本發明涉及組織工程
技術領域：
，特別是涉及一種交聯脫細胞羊膜及其制備方法和應用。
背景技術：
：真皮替代物的研究一直是組織工程皮膚的重點和難點，也是復合型真皮替代物發展的基礎。真皮替代物作為創面修復過程中的支架結構，不僅能促進表皮細胞的增殖、遷移和分化，調節基底膜的形成，而且能引導成纖維細胞和血管內皮細胞的浸潤增殖，沉積新的膠原和形成新的血管，從而實現真皮結構重建。現有的真皮替代物在一定程度上能夠模擬正常真皮的組織結構特點，但是除脫細胞真皮外，普遍都缺乏基底膜結構成分。即使采用脫細胞真皮，為了去除表皮細胞層和真皮中的成纖維細胞和血管內皮細胞，一般需要很強的細胞清除劑處理，會對真皮的基底膜成分產生嚴重的破壞。人羊膜來源于胎盤的最內層，可在分娩時獲得，主要由三部分結構組成：單層立方狀表皮細胞，富含細胞生長因子的厚基底膜，以及成纖維細胞散在其中的疏松網狀纖維基質。羊膜基質含有I型膠原、IV型膠原、VII型膠原、彈性蛋白和糖胺聚糖等成分，類似于人體的真皮。羊膜的基底膜主要成分為層粘連蛋白、IV型和VII型膠原，與皮膚和角膜的基底膜成分相似，是人體內最厚的基底膜。同時，羊膜還具有促進上皮化、抑制瘢痕增生、抗炎癥、抗血管生成、抗菌和抗病毒等生物特性，且免疫原性極低，因而被廣泛用作外科手術材料和創面覆蓋物，用于修復各種組織缺損。在實際應用中，羊膜使用時既可以保留失活的表皮細胞，也可以完全去除表皮細胞。完整羊膜含有大量的細胞生長因子，有利于細胞培育過程中干細胞特性的維持。而脫細胞羊膜借助于良好的基質和基底膜成分，能促進培育細胞的增殖、遷移和分化。部分體細胞在脫細胞羊膜上的擴增速度要明顯快于完整羊膜。但是，脫細胞羊膜的機械強度、生物穩定性和可操作性仍然不佳。技術實現要素：基于此，有必要提供一種機械強度高的交聯脫細胞羊膜及其制備方法和應用。一種交聯脫細胞羊膜的制備方法，包括如下步驟：(1)浸泡：將脫細胞羊膜浸泡于25-35mlMES緩沖液中55-65min；(2)交聯反應：向浸泡后的羊膜所在的緩沖液中加入水溶性碳二亞胺，并使碳二亞胺的濃度為0.01-0.1mmol/mg，置于37±0.5℃的恒溫搖床上，轉速28-32rpm，交聯反應1-10min；(3)蒸餾水清洗，真空冷凍干燥，即得。在其中一個實施例中，在步驟(1)中，所述脫細胞羊膜由以下步驟制備而成：在無菌條件下，從胎盤的內層剝下羊膜，放置到無菌生理鹽水中，反復沖洗去除羊膜表面的臟污，并去除所述羊膜的絨毛膜，用pH為7.2-7.4的PBS溶液反復漂洗；將漂洗后的羊膜在抗生素溶液中浸泡3-7min，再在pH為7.2-7.4的PBS溶液浸泡8-12min此過程重復多次；用pH為7.2-7.4的PBS溶液重新沖洗后，置于含DMEM：甘油體積比為1：0.5-2的溶液中，-80℃條件下儲存6-8個月；取無感染的儲存所得羊膜，4℃條件下，置于在質量百分比為0.1％-0.5％的trypsin-EDTA水溶液中孵育過夜；再用含有血清的DMEM培養基對其進行終止消化，用pH為7.2-7.4的PBS沖洗多次，備用。在其中一個實施例中，在步驟(1)中，所述脫細胞羊膜的制備過程，還包括復蘇的步驟：將無感染的儲存6-8個月的所述羊膜預先置于-80±5℃和37±2℃環境中反復凍融2-4次后，備用。上述交聯脫細胞羊膜的制備方法制備而成的交聯脫細胞羊膜。上述交聯脫細胞羊膜在制備具有創面修復功效的復合型皮膚替代物中的應用。在其中一個實施例中，所述復合型皮膚替代物的制備過程包括如下步驟：將上述交聯脫細胞羊膜制成片狀，將片狀的所述交聯脫細胞羊膜的基質所在面貼于培養皿的底部，置于培養箱中；將表皮細胞以1×105的接種量接種于所述交聯脫細胞羊膜的非基質所在面，加入皮膚培養基G進行培養；所述培養基G的配方為：450mLDMEM/F12培養基、50mLFBS、0.01-1μmol/L胰島素、0.01-1mmol/mL非必需氨基酸、10-50ng/mLhEGF、100IU/mL青霉素、15-50μg/mLBPE和100-500μg/mL氯化鈣；每天更換培養液，培養6-8天，即得所述復合型皮膚替代物。在其中一個實施例中，所述表皮細胞由尿液細胞經誘導培養而成，其誘導培養的過程如下：S1，從尿液中提取尿細胞；S2，將所述尿細胞培養為iPS細胞；S3，將所述iPS細胞誘導培養獲得間充質干細胞；S4，將所述間充質干細胞誘導培養，即得所述表皮細胞。在其中一個實施例中，在步驟S1中，所述尿細胞的融合度不小于80％。在其中一個實施例中，在步驟S2中，所述iPS細胞的融合度不小于90％。在其中一個實施例中，在步驟S3中，所述間充質干細胞的融合度不小于90％。本發明的有益效果如下：本發明利用水溶性碳二亞胺對脫細胞羊膜進行交聯反應處理，得到的交聯脫細胞羊膜保留了基底膜中的IV型膠原、VII型膠原、彈性蛋白和糖胺聚糖等成分，并保留了細胞因子的生物活性，同時機械強度增強、抗酶降解能力提高且可操作性好。本發明獲得脫細胞羊膜作為培養基質，可以促進表皮細胞在非基質所在表面的生長，加快表皮細胞的體外增殖速度，而且保持了良好的生物組織相容性，可作為皮膚替代物，縮短了皮膚替代物的制備時間。進一步，本發明將表皮細胞接種于交聯脫細胞羊膜的非基質所在表面培養獲得復合型皮膚替代物，能夠促進創面愈合，促進皮膚結構重建，減輕創面收縮。本發明所用的表皮細胞是從尿細胞經過一系列的誘導、培養獲得的，取材方便，對人體無傷害。附圖說明圖1為未脫細胞羊膜的基底膜結構的電鏡圖；圖2為脫細胞羊膜的基底膜結構的電鏡圖；圖3為交聯脫細胞羊膜培養表皮細胞兩天后的電鏡圖；圖4為脫細胞羊膜培養的表皮細胞兩天后的電鏡圖；圖5為由交聯脫細胞羊膜和表皮細胞制備的復合型皮膚替代物的產品圖片；圖6為由脫細胞羊膜和表皮細胞制備的表皮-真皮替代物的產品圖片；圖7為交聯脫細胞羊膜修復裸鼠皮膚缺損兩周后的皮膚愈合效果圖；圖8為脫細胞羊膜修復裸鼠皮膚缺損兩周后的皮膚愈合效果圖。具體實施方式為了便于理解本發明，下面對本發明進行更全面的描述。下文中給出了本發明的較佳實施例。但是，本發明可以以許多不同的形式來實現，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發明的公開內容的理解更加透徹全面。一實施方式的交聯脫細胞羊膜，其制備方法包括如下步驟：(1)制備脫細胞羊膜：取剖腹產孕婦的胎盤，并經血清檢測排除感染原。所用胎盤選自醫療廢棄的胎盤，經醫院同意，并經醫學倫理會審查可以用于實驗研究。在無菌條件下，從胎盤的內層剝下羊膜，放置到無菌生理鹽水中，反復沖洗去除羊膜表面的血跡，并去除羊膜的絨毛膜，用pH為7.2-7.4的PBS溶液反復漂洗。將漂洗后的羊膜在抗生素溶液中浸泡3-7min，再在pH為7.2-7.4的PBS浸泡8-12min，此過程重復多次。用pH為7.2-7.4的PBS溶液重新沖洗后，置于含DMEM：甘油體積比為1：0.5-2的溶液中，-80℃條件下儲存6-8個月以覆蓋感染的窗口期。取無感染的儲存所得羊膜，置于-80±5℃和37±2℃環境中反復凍融2-4次后，在4℃條件下，置于在質量百分比為0.1％-0.5％的trypsin-EDTA水溶液中孵育過夜。再用含有血清的DMEM培養基對其進行終止消化，用pH為7.2-7.4的PBS溶液沖洗多次，備用。(2)制備交聯脫細胞羊膜將上述(1)中所得的脫細胞羊膜浸泡于25-35mlMES緩沖液中55-65min。向浸泡后的羊膜所在的緩沖液中加入碳二亞胺，并使水溶性碳二亞胺的濃度為0.01-0.1mmol/mg，置于37±0.5℃的恒溫搖床上，轉速為28-32rpm，交聯反應1-10min。蒸餾水清洗，真空冷凍干燥，即得。上述方法制備而成的交聯脫細胞羊膜在制備具有創面修復功效的復合型皮膚替代物中的應用。一實施方式的復合型皮膚替代物，其制備方法包括如下步驟：(1)誘導形成表皮細胞S1，從尿液中提取尿細胞：收集尿液，添加2mL兩性霉素(青霉素和鏈霉素的混合液，兩者濃度均為為500μg/ml)。如不立刻進行后續操作，則將尿液存儲于4℃冰箱，并于當天完成后續操作。把收集的尿液進行離心，去上清液，收集位于離心管底部的混懸液1-5mL。將收集的混懸液全部合并后，加入收集所得液體6-10體積的含有兩性霉素的PBS(兩性霉素與PBS溶液的體積比為5:95)，輕輕混勻，吸去上清，得底部混懸液。對6孔板進行預處理，即將需要用的孔預先用0.1％明膠包被處理20min以上的，再吸出0.1％的明膠。將獲得的底部混懸液置于6孔板的預處理后的孔中，并向該孔中加入2mL培養液A和3μLPrimocin(原代細胞抗生素)，置于培養箱內，37℃條件下培養，待尿細胞貼壁生長后，吸去培養液A，用PBS洗一遍，再更換培養液A繼續培養。其中，培養液A的配方為：REGM培養基與MEF培養基以1：1的比例混合。當尿細胞融合度達到80％，則可進行后續傳代培養。S2，將尿細胞培養為iPS細胞：將表達轉錄調控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28，各1-5μg混合后共同導入尿細胞中。再將含有表達轉錄調控因子的尿細胞置于預先用matrigel包被的6孔板中，用培養液A培養。轉染后第2d(天)，將培養基更換為培養液B。以后，每天更換新鮮培養液B使克隆繼續增殖。其中，培養液B為mTesR1培養基。轉染后第7d，鏡下觀察形態，挑取與人胚胎干細胞相近細胞，并接種于用matrigel包被的12孔板中，培養液B培養獲得誘導多能干細胞(iPS細胞)。S3，將iPS細胞誘導培養獲得間充質干細胞：棄除原有iPS細胞培養液B，加DMEM/F12培養液清洗一遍，棄除，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液，消化5min后，在400g轉速下離心5min，收集細胞沉淀，以1：3的比例置于已被Matrigel包被處理的6孔板中，進行傳代培養；待iPS細胞長至6孔板體積的70％-80％時，PBS沖洗一遍后，更換間充質干細胞誘導培養基C，并每兩天更換一次培養基。其中，間充質干細胞誘導培養基C的配方為：450mLDMEM基礎培養基、50mLFBS、1-5mmol/LL-谷酰胺、50-100μg/LbFGF和10-8mol/L地塞米松。培養4-6d后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液進行消化，采用間充質干細胞培養基D重懸細胞，制成單細胞懸液，接種至0.1％明膠預先包被處理的細胞培養皿中。其中，間充質干細胞培養基D的培養液配方為：450mLDMEM/F12培養基、50mLFBS、10-50ng/mLhEGF、1-6ng/mLHGF、1-4ng/mLbFGF、1-10ng/mLPDGF、1-10ng/mLIGF和2-10ng/mLTGF-β。當細胞達到90％融合后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液消化細胞并按照1：3的比例進行細胞傳代。S4，將間充質干細胞誘導培養形成表皮細胞：棄除上述間充質干細胞培養液D，加DMEM/F12培養液清洗一遍，棄除清洗液，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液，消化5min后，在400g轉速下離心5min，收集細胞沉淀，以1：3的比例進行傳代，傳至已被Matrigel包被處理的6孔板中。待間充質干細胞長至6孔板體積的70％-80％時，pH為7.2-7.4的PBS溶液沖洗一遍后，更換表皮細胞誘導培養基E，并每兩天更換一次培養基E。其中，表皮細胞誘導培養基E的培養液配方為：450mLDMEM基礎培養基、50mLFBS、10-40μg/LKGF、20-80μg/LTGF-β、6-15μg/LPDGF-AB、10-25μg/LVEGF、1-7μg/LIL-2和0.1-0.75μg/ml氫化可的松。培養4-6d后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液進行消化，采用表皮細胞培養基F重懸細胞，制成單細胞懸液，接種至細胞培養皿中培養。其中，表皮細胞培養基F的配方為：450mLDMEM/F12培養基、50mLFBS、0.1-1ng/mL氫化可的松、1×10-10mol/L霍亂毒素、0.01-0.1ng/mL胰島素、1×10-7mol/L三碘甲狀腺原氨酸、1.8×10-4mol/L腺嘌呤、100IU/mL青霉素、10-25ng/mLhEGF、5-15μg/mL轉鐵蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-7μMY-27632和0.01-0.5mg/mL羧甲基殼聚糖。當細胞達到90％融合后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液消化細胞并按照1：3的比例進行細胞傳代。(2)將上述制備的交聯脫細胞羊膜制成片狀，將片狀的交聯脫細胞羊膜的基質所在面貼于培養皿的底部，置于培養箱中。(3)將(1)中誘導形成的表皮細胞以1×105的接種量接種于交聯脫細胞羊膜的非基質所在面，加入皮膚培養基-培養液G進行培養。培養液G的配方為：450mLDMEM/F12培養基、50mLFBS、0.01-1μmol/L胰島素、0.01-1mmol/mL非必需氨基酸、10-50ng/mLhEGF、100IU/mL青霉素、15-50μg/mLBPE和100-500μg/mL氯化鈣。每天更換培養液，培養6-8天，即得。在本實施方式中表皮細胞是從尿細胞經過一系列的誘導、培養獲得的，取材方便，對人體無傷害，屬于優選的情況。下面結合具體的實施例對本發明做進一步說明。實施例1本實施例提供一種脫細胞羊膜，其制備過程如下：(1)取剖腹產孕婦的胎盤，并經血清檢測排除HIV、梅毒、HBV和HCV等感染。(2)在無菌條件下從胎盤的內層剝下羊膜，置于無菌生理鹽水中，反復沖洗，除去羊膜表面的血跡，并用鑷子鈍性去除羊膜的絨毛膜。(3)將羊膜用pH為7.3的PBS溶液反復漂洗多遍后，用抗生素溶液浸泡5分鐘，PBS溶液浸泡10分鐘，此過程重復3次。(4)PBS溶液重新沖洗后將羊膜放入含DMEM和甘油的體積比為1：1的溶液中，-80℃條件下儲存6個月以覆蓋感染的窗口期。(5)檢測無病毒感染的儲存后的羊膜，從-80℃到37℃反復凍融三次，之后置于0.25％的trypsin-EDTA水溶液中，在4℃條件下，孵育過夜。(6)用含有血清的DMEM對孵育過夜后的羊膜進行終止消化，之后用PBS溶液沖洗三次。實施例2本實施例提供一種交聯脫細胞羊膜，其制備過程如下：將實施例1制得的脫細胞羊膜浸泡于30mLMES緩沖液中1h，之后加入EDC，并使其在MES緩沖液中的濃度為0.05mmol/mg，置于恒溫搖床上，設置轉速為30rpm，37℃條件下，交聯反應5min，蒸餾水清洗，真空冷凍干燥，即得。實施例3本實施例提供一種復合型皮膚替代物，其制備過程如下：(1)從尿液中提取尿細胞：收集尿液，添加2mL兩性霉素(青霉素和鏈霉素的混合液，兩者的濃度均為500μg/mL)。把收集的尿液，置于50mL離心管中，在400g轉速下，離心10min，去除上清液，收集位于離心管底部的混懸液5mL。將合并后的5mL混懸液中加入30mL含有兩性霉素的PBS(兩性霉素與PBS溶液的體積比為5:95)，輕輕混勻，吸去上清，得底部混懸液。對6孔板進行預處理，即將需要用的孔預先用0.1％明膠包被處理20min以上的，再吸出0.1％的明膠。將獲得的底部混懸液置于6孔板的預處理后的孔中，并向該孔中加入2mL培養液A和3μLPrimocin，置于培養箱內，37℃條件下培養，待尿細胞貼壁生長后，吸去培養液A，用PBS洗一遍，再更換為培養液A繼續培養。其中，培養液A的配方為：REGM培養基與MEF培養基以1：1的比例混合。當尿細胞融合度達到80％，進行后續傳代培養。S2，將尿細胞培養為iPS細胞：將表達轉錄調控因子2μgOCT4、2μgSOX2、2μgNANOG、2μgKLF4和2μgLIN28共同導入步驟S1中得到的尿細胞中。再將含有表達轉錄調控因子的尿細胞置于預先用matrigel包被的6孔板中，用培養液A培養。轉染后第2d，將培養基更換為培養液B。以后，每天更換新鮮培養液B使克隆繼續增殖。其中，培養液B為mTesR1培養基。轉染后第7d，電鏡下觀察形態，挑取與人胚胎干細胞相近細胞，并接種于用matrigel包被的12孔板中，培養液B培養獲得誘導多能干細胞(iPS細胞)。S3，將iPS細胞誘導培養獲得間充質干細胞：棄除原有iPS細胞培養液B，加DMEM/F12培養液清洗一遍，棄除，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液，消化5min后，在400g轉速下離心5min，收集細胞沉淀，以1：3的比例置于已被Matrigel包被處理的6孔板中，進行傳代培養；待iPS細胞長至6孔板體積的75％時，PBS沖洗一遍后，更換間充質干細胞誘導培養基C，并每兩天更換一次培養基。其中，間充質干細胞誘導培養基C的配方為：450mLDMEM基礎培養基、50mLFBS、3mmol/LL-谷酰胺、80μg/LbFGF和9mol/L地塞米松。培養4-6d后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液進行消化，采用間充質干細胞培養基D重懸細胞，制成單細胞懸液，接種至0.1％明膠預先包被處理的細胞培養皿中。其中，間充質干細胞培養基D的培養液配方為：450mLDMEM/F12培養基、50mLFBS、35ng/mLhEGF、4ng/mLHGF、2ng/mLbFGF、8ng/mLPDGF、6ng/mLIGF和6ng/mLTGF-β。當細胞達到90％融合后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液消化細胞并按照1：3的比例進行細胞傳代。S4，將間充質干細胞誘導培養形成表皮細胞：棄除上述間充質干細胞培養液D，加DMEM/F12培養液清洗一遍，棄除清洗液，加含0.5mMEDTA的DPBS，消化5min后，在400g轉速下離心5min，收集細胞沉淀，以1：3的比例進行傳代，傳至已被Matrigel包被處理的6孔板中。待間充質干細胞長至6孔板體積的75％時，PBS沖洗一遍后，更換表皮細胞誘導培養基E，并每兩天更換一次培養基E。其中，表皮細胞誘導培養基E的培養液配方為：450mLDMEM基礎培養基、50mLFBS、25μg/LKGF、50μg/LTGF-β、9μg/LPDGF-AB、18μg/LVEGF、4μg/LIL-2和05μg/ml氫化可的松。培養4-6d后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液進行消化，采用表皮細胞培養基F重懸細胞，制成單細胞懸液，接種至細胞培養皿中培養。其中，表皮細胞培養基F的配方為：450mLDMEM/F12培養基、50mLFBS、0.7ng/mL氫化可的松、1×10-10mol/L霍亂毒素、0.06ng/mL胰島素、1×10-7mol/L三碘甲狀腺原氨酸、1.8×10-4mol/L腺嘌呤、100IU/mL青霉素、18ng/mLhEGF、10μg/mL轉鐵蛋白、7μg/mL谷氨酸、4μMY-27632和0.3mg/mL羧甲基殼聚糖。當細胞達到90％融合后，加含0.5mMEDTA的DPBS溶液消化細胞并按照1：3的比例進行細胞傳代。(2)將上述制備的交聯脫細胞羊膜制成片狀，將片狀的交聯脫細胞羊膜的基質所在面貼于培養皿的底部，置于培養箱中。將(1)中誘導形成的表皮細胞以1×105的接種量接種于交聯脫細胞羊膜的非基質所在面，加入皮膚培養基-培養液G進行培養。其中，培養液G的配方為：450mLDMEM/F12培養基、50mLFBS、0.5μmol/L胰島素、0.5mmol/mL甘氨酸、30ng/mLhEGF、100IU/mL青霉素、30μg/mLBPE和300μg/mL氯化鈣。每天更換培養液，培養6-8天，即得。實施例4本實施例提供一種由實施例1制備的脫細胞羊膜為培養基質制備的表皮-真皮替代物。具體制備過程和參數參見實施例3。實施例5檢測及結果分析(一)電鏡測試及結果分析(1)脫細胞羊膜與未脫細胞羊膜的電鏡觀察將實施例1制備獲得的脫細胞羊膜與未脫細胞羊膜在電鏡下觀察基底膜并拍照，結果見圖1和圖2。通常，完整羊膜上皮細胞的基底面通過大量的半橋粒結構緊密連接在基底膜表面。由圖1可以看出，冷凍保存的未脫細胞處理的羊膜后，雖然上皮細胞的細胞形態有所損傷，但羊膜基質的結構完整性并未受影響，間質網狀膠原纖維致密，排列整齊。由圖2可以看出，脫細胞羊膜在完全去除上皮細胞的同時，基本保留了基底膜的完整結構，基質也未受影響。(2)表皮細胞在交聯脫細胞羊膜和脫細胞羊膜上的生長狀況及皮膚替代物的觀察在電鏡下觀察實施3和實施例4的表皮細胞培養2d后的生長狀況，見圖3和圖4。由圖3和圖4可知，表皮細胞在交聯脫細胞羊膜上比脫細胞羊膜上的生長狀態好，且增殖速度較快。在電鏡下觀察實施3和實施例4表皮細胞培養4d后皮膚替代物的結構，見圖5和圖6。由圖5可以看出，由交聯脫細胞羊膜制備的復合型皮膚替代物的表面光滑平整，具有一定的硬度，能平鋪培養皿表面。而圖6可以看出，脫細胞羊膜聯羊膜制備的皮膚替代物極其柔軟，在培養皿中平鋪后容易卷曲。(二)機械強度測試對實施例1制備獲得的脫細胞羊膜和實施例2制備獲得的交聯脫細胞羊膜進行機械性能的檢測，其檢測過程如下：將實施例1的制備獲得的脫細胞羊膜分別切成尺寸為2cm×6cm的待測試樣3份，依次命名脫細胞羊膜1、脫細胞羊膜2和脫細胞羊膜3。將實施例2制備獲得的交聯脫細胞羊膜分別切成尺寸為2cm×6cm的待測試樣3份，依次命名為交聯脫細胞羊膜1、交聯脫細胞羊膜2和交聯脫細胞羊膜3。將待測試樣分別置于智能電子拉力試驗機，用50N傳感器，速度20mm/min，測定樣品的拉伸強度、斷裂伸長率和彈性模量，統計結果見表1。由表1計算可得，交聯脫細胞羊膜的平均拉伸強度為(1.598±0.0356)MPa、平均斷裂伸長率為(26.194±0.331)％及平均彈性模量為(0.0055±0.0004)Gpa。脫細胞羊膜的平均拉伸強度為(0.849±0.0344)MPa、平均斷裂伸長率為(15.729±0.483)％及平均彈性模量為(0.0028±0.0002)GPa。與未交聯處理的脫細胞羊膜相比，交聯脫細胞羊膜的機械強度顯著增加(P<0.05)。表1交聯前后脫細胞羊膜的機械強度變化組別拉伸強度(MPa)斷裂伸率(％)彈性模量(GPa)交聯脫細胞羊膜11.52825.6420.0048交聯脫細胞羊膜21.64226.7860.0055交聯脫細胞羊膜31.62626.1540.0062脫細胞羊膜10.79915.2260.0027脫細胞羊膜20.83315.7740.0029脫細胞羊膜30.91516.1880.0030(三)細胞生長因子含量的檢測將脫細胞羊膜1、脫細胞羊膜2、脫細胞羊膜3、交聯脫細胞羊膜1、交聯脫細胞羊膜2和交聯脫細胞羊膜3分別置于細胞培養皿中，加入無血清培養基，置于細胞培養箱，37℃條件下，靜置7d，收集浸提的培養液并用0.22μm過濾器過濾消毒，用ELISA試劑盒檢測EGF、FGF、HGF含量。重復測定3次，統計結果見表2。表2交聯前后脫細胞羊膜的細胞因子含量的變化組別EGF(pg/mL)FGF(pg/mL)HGF(pg/mL)交聯脫細胞羊膜10.0350.0260.142交聯脫細胞羊膜20.0320.0250.145交聯脫細胞羊膜30.030.0220.14脫細胞羊膜10.030.0250.138脫細胞羊膜20.0370.0270.135脫細胞羊膜30.0290.0280.136由表2計算可得，交聯脫細胞羊膜中EGF的平均含量為(0.0323±0.00145)pg/mL，FGF的平均含量為(0.024±0.0012)pg/mL，HGF的平均含量為(0.142±0.00145)pg/mL。脫細胞羊膜的EGF的平均含量為(0.032±0.0025)pg/mL，FGF的平均含量為(0.0267±0.0008)pg/mL，HGF的平均含量(0.136±0.0008)pg/mL。與未交聯處理的脫細胞羊膜相比，交聯脫細胞羊膜的細胞生長因子的含量無顯著性變化(P＞0.05)。(四)毒性檢測對實施例1制備獲得的脫細胞羊膜和實施例2制備獲得的交聯脫細胞羊膜以分別置于無血清的培養基中，37℃下靜置7d后，收集浸提培養液并用0.22μm過濾器過濾消毒。將表皮細胞以1×104cells/孔的濃度接種至96孔板中，表皮細胞培養基培養待細胞完全貼壁后換成浸提培養液培養，隔日換液。培養2d、4d和6d后分別用CCK-8檢測法測定96孔板中表皮細胞的細胞活性，并用分光光度計(Bio-Tek)讀取450nm的吸光度(OD450nm)。重復3次，統計結果見表3。表3交聯前后脫細胞羊膜的細胞毒性檢測組別OD值成活率/％交聯脫細胞羊膜2d0.77±0.03103.45±2.37交聯脫細胞羊膜4d0.88±0.01107.77±4.69交聯脫細胞羊膜6d1.52±0.09109.83±9.58脫細胞羊膜2d0.67±0.01100脫細胞羊膜4d0.80±0.05102.55±10.58脫細胞羊膜6d1.40±0.02105.22±7.54由表3的結果可知，表皮細胞分別培養2d、4d和6d之后，交聯脫細胞羊膜與脫細胞羊膜相比的細胞毒性均無明顯差異(P>0.05)。實施例5本實施例提供修復裸鼠皮膚缺損的效果證明試驗。選取4周齡裸鼠20只，1％戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，于背部兩側各作約直徑2cm的全層皮膚缺損創面，隨機分為兩組，依次命名為交聯處理組和未交聯處理組，每組10只。將實施例3制備的復合型皮膚替代物移植到交聯處理組的裸鼠缺損創面上，表皮面朝上，4號手術線間斷縫合牢固，2周后觀察創面的愈合情況，結果見圖7。由圖7可知，交聯處理組的裸鼠的新生表皮接近正常皮膚，質軟，表面平整光滑，創面輕微收縮。將實施例4制備的表皮-真皮替代物移植到未交聯處理組的裸鼠缺損創面上，同法處理，2周后觀察創面的愈合情況，結果見圖8。由圖8可知，2周后未交聯處理組的裸鼠的表皮比較薄，傷口的愈合不完整，創面具有一定程度的收縮。以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。當前第1頁1 2 3