本發明涉及一種羊膜間充質干細胞的分離培養方法，屬于生物技術領域。

背景技術：

人羊膜干細胞具有高度自我更新、增殖、可植入性和多系分化能力，異基因個體移植后無免疫排斥和致瘤性風險。而且，人羊膜干細胞來源于產婦分娩后廢棄的胎盤，應用到臨床不會帶來醫學倫理爭議。羊膜干細胞具有明顯的集落形成能力、增殖能力、胚胎干性、免疫調節能力及無異基因移植排斥反應與致瘤性等優良生物學特性，可用來進行諸多疾病的細胞治療、組織器官損傷的修復與重建，是再生醫學領域理想的種子細胞資源，具有廣闊的臨床應用前景。

近些年來，大量的研究表明，羊膜干細胞，既具有向同一胚層不同類型細胞分化的多向分化潛能，又有跨系跨胚層分化的能力，展示出良好的可塑性。如，起源中胚層的細胞既能向成骨、軟骨、脂肪等中胚層細胞分化，亦可向胰腺細胞、肝細胞等內胚層細胞、神經細胞等外胚層細胞分化。

人羊膜干細胞不僅具有顯著的自我更新能力及跨系跨胚層多系分化潛能，且相對胚胎干細胞和其它成體干細胞，其資源豐富，易獲得，無倫理爭議，免疫原性低，無致瘤風險，還具分泌免疫抑制因子、神經營養因子等多種生物活性因子的強大旁分泌或自分泌功能。這些特性賦予了它在組織工程、細胞治療、基因治療等相關再生醫學領域不可估量的臨床應用價值。

現有技術中，干細胞的培養體系主要應用含動物血清(如FBS)的培養基，BMSCs和臍帶血間充質干細胞的培養也多采用FBS。人羊膜間充質干細胞的培養體系通常為LG-DMEM培養基中加入10％的FBS、2mmol/L L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸/L 2-巰基乙醇和1mmol/L丙酮酸鈉。但FBS等動物血清的應用，在干細胞移植后，輸入異種蛋白對患者存在潛在的威脅，可產生抗FBS抗體及其他尚未知曉的不良反應，而且可能造成人與其他物種間病毒感染的傳播。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供一種新的人羊膜間充質干細胞的分離培養方法。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，步驟如下：

(一)細胞分離

(1)羊膜取自足月剖宮產健康產婦，采集后處理；

(2)將直徑為的羊膜用0.9％氯化鈉溶液清洗，剪碎至約1mm×1mm×1mm，經0.1％膠原酶和％的胰酶37℃消化用α-MEM培養基稀釋至40ml；

(3)將上述液體先后用100目及200目濾網過濾，去未消化的組織；

(4)過濾后的含細胞的液體置于離心管中，配平后放置在低溫離心機內，以離心力300Xg，溫度4±2℃，離心8分鐘；

停機后輕輕取出離心管置于試管架上，離心管內容物分為二部分，上層為膠原酶、胰酶和α-MEM培養基，下層為組織碎塊與細胞混合物；

將上層膠原酶、胰酶和α-MEM培養基吸出；

(7)將所分離的人羊膜單個核細胞用α-MEM培養基稀釋后2000r/min離心10min洗二次；

(二)細胞培養

將分離的人羊膜單個核細胞按個細胞/cm²接種于塑料培養瓶，培養于37℃，培養箱，培養液為人羊膜間充質干細胞專用培養基；24小時后換液，棄非貼壁細胞，以后每2～3天換液；待人羊膜間充質干細胞生長到70～80％融合，用％胰酶消化1～2分鐘，按0.8×10⁴～1.0×10⁴個細胞/cm²傳代；每2～3天用人羊膜間充質干細胞專用培養基中傳代一次，使細胞濃度維持在5×10⁵～10×10⁵個細胞/M1；每次傳代培養的條件均為37℃，傳代得到人羊膜間充質干細胞。

所述人羊膜間充質干細胞專用培養基由α-MEM培養基、人血漿和人血白蛋白組成，人血漿在所述人羊膜間充質干細胞專用培養基中的濃度是10％(體積百分濃度)，人血白蛋白在該人羊膜間充質干細胞專用培養基中的濃度是1％(體積百分濃度)。

所述人血漿是人AB血漿。

本發明所提供的人羊膜間充質干細胞，采用上述人羊膜間充質干細胞的分離培養方法培養得到。

本發明所述的人羊膜間充質干細胞表達如下三種細胞膜分子：人白細胞分化抗原CD73、人白細胞分化抗原CD90和人白細胞分化抗原不表達人白細胞分化抗原和人白細胞抗原HLA-DR。

人羊膜間充質干細胞專用培養基，由α-MEM培養基、人血漿和人血白蛋白組成。人血漿在所述人羊膜間充質干細胞專用培養基中的濃度是10％(體積百分濃度)，人血白蛋白在該人羊膜間充質干細胞專用培養基中的濃度是1％(體積百分濃度)。

本發明提供了人羊膜間充質干細胞的制備方法：離體的人羊膜單個核細胞在如下人羊膜間充質干細胞專用培養基中培養并傳代得到人羊膜間充質干細胞：在α-MEM培養基中添加人血漿和人血白蛋白得到的培養基，所述人血漿在所述人羊膜間充質干細胞專用培養基中的濃度是10％(體積百分濃度)，所述人血白蛋白在所述人羊膜間充質干細胞專用培養基中的濃度是1％(體積百分濃度)。

本發明的優點是：本發明的培養方法和培養基不含動物血清，既能促進人羊膜間充質干細胞增殖，細胞純度高，可滿足細胞治療的臨床條件，安全可靠，可用于干細胞體外擴增。本品添加劑均使用人源產品，且均達到臨床應用級別；制備及購買方便、快捷。

下面結合附圖和具體實施方式對本發明做詳細說明，并非對本發明的限定，凡依照本申請公開文件所進行的任何本領域的等同替換，均屬于本發明的保護范圍。

附圖說明

圖1A為人羊膜間充質干細胞剛貼壁時的情況

圖1B為人羊膜間充質干細胞開始生長時的情況

圖1C為人羊膜間充質干細胞增殖后的情況

圖2A為人羊膜間充質干細胞通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原CD73的表達情況

圖2B為人羊膜間充質干細胞通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原CD90的表達情況

圖2C為人羊膜間充質干細胞通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原的表達情況

圖2D為人羊膜間充質干細胞通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原的表達情況

圖2E為人羊膜間充質干細胞通過流式細胞儀檢測人白細胞抗原HLA-DR的表達情況

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

α-MEM培養基為Gibco公司的產品，其產品編號為：11900024；人AB血漿購自北京紅十字血液中心；注射用人血白蛋白(國藥準字S20030043)。

人羊膜間充質干細胞專用培養基：α-MEM(Gibco，USA)培養基中添加人AB血漿和人血白蛋白的培養基，人AB血漿在該人羊膜間充質干細胞專用培養基中的濃度是10％(體積百分濃度)，人血白蛋白在該人羊膜間充質干細胞專用培養基中的濃度是1％(體積百分濃度)，pH值為7.2-7.4。

實施例1、人羊膜間充質干細胞的分離培養

1、細胞分離

(1)羊膜取自足月剖宮產健康產婦，采集后處理。

(2)將直徑為的羊膜用0.9％氯化鈉溶液清洗，剪碎至約1mm×1mm×1mm，經0.1％膠原酶和％的胰酶37℃消化用α-MEM(Gibco，USA)稀釋至40ml。

(3)將上述液體先后用100目及200目濾網過濾，去未消化的組織。

(4)過濾后的含細胞的液體置于離心管中，配平后放置在低溫離心機內，以離心力300Xg，溫度4±2℃，離心8分鐘。

停機后輕輕取出離心管置于試管架上，離心管內容物分為二部分，上層為膠原酶、胰酶和α-MEM培養基，下層為組織碎塊與細胞混合物。

將上層膠原酶、胰酶和α-MEM培養基吸出。

(7)將所分離的人羊膜單個核細胞用α-MEM培養基稀釋后2000r/min離心10min洗二次。

2、細胞培養

將分離的人羊膜單個核細胞按個細胞/cm²接種于塑料培養瓶，培養于37℃，培養箱，培養液為人羊膜間充質干細胞專用培養基。24小時后換液，棄非貼壁細胞，以后每2～3天換液；待人羊膜間充質干細胞生長到70～80％融合，用％胰酶(Sigma，USA)消化(1～2分鐘)，按0.8×10⁴～1.0×10⁴個細胞/cm²傳代。每2～3天用該人羊膜間充質干細胞專用培養基中傳代一次，使細胞濃度維持在5×10⁵～10×10⁵個細胞/mL。每次傳代培養的條件均為37℃，傳代得到人羊膜間充質干細胞。

圖1A為人羊膜間充質干細胞剛貼壁時的情況，為形態呈細小的圓形。

圖1B為人羊膜間充質干細胞開始生長時的情況，48小時后，細胞開始增殖，向長梭形轉變。

圖1C為人羊膜間充質干細胞增殖后的情況，一周后細胞開始增殖形成大小不等的細胞集落。

實施例2：流式細胞檢測

一、方法

實施例1得到的人羊膜間充質干細胞，用抗人CD73單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原CD73的表達情況，用抗人CD90單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原CD90的表達情況，用抗人單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原的表達情況，用抗人單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細胞儀檢測人白細胞分化抗原的表達情況，用抗人白細胞抗原HLA-DR單克隆抗體(BioLegend，USA)通過流式細胞儀(型號FACSCaliburBD公司)檢測人白細胞抗原HLA-DR的表達情況。

二、結果

結果如圖2A、圖2B、圖2C、圖2D和圖2E所示，表明該人羊膜間充質干細胞表達人白細胞分化抗原CD73、人白細胞分化抗原CD90和人白細胞分化抗原不表達人白細胞分化抗原和人白細胞抗原HLA-DR。流式細胞儀檢測結果表明該人羊膜間充質干細胞的純度達到