本發明涉及能夠調節脊椎動物中神經干細胞的增殖及分化的fam19a5在診斷、預防或治療中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病中的醫藥用途。
背景技術：
在發育初期，神經板形成神經管，然后經過發育過程，神經管內的腔室形成腦室。與腦室最近的細胞層為腦室區。通過神經形成過程，在腦室區之上形成額外的增殖細胞層，使之稱為腦室下區。腦室區和腦室下區中的祖細胞具有神經干細胞的特性，而且通過復雜的控制系統遷移至皮質板(corticalplate)【dehayandkennedy,natrevneurosci8:438-450,2007；molyneauxetal.,natrevneurosci8:427-437,2007；angevineandsidman,nature192:766-768,1961；cavinessandtakahashi,braindev17:159-163,1995】。
神經干細胞具有持續分裂的能力，即自我更新能力，其可被分化成中樞神經系統的神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。在胚胎期，主要經過分化成神經元的過程，而在出生后，會經過分化成膠質細胞的過程【bayeretal.,jcompneurol307:499-516,1991；millerandgauthier,neuron54:357-369,2007】。
從神經干細胞向神經元和膠質細胞的分化是在腦的發育過程和成體腦中能夠持續觀察到的現象。在成體腦中，神經發生產生于兩處不同的腦區域，即側腦室的腦室下區和海馬齒狀回。在腦室下區中，與腦室最近的室管膜細胞及隨之分布的星形膠質細胞可作為神經干細胞，這兩種細胞通過過渡放大細胞(transientamplifyingcell)形成成神經細胞(neuroblasts)【doetsch,curropingenetdev13:543-550,2003；doetschetal.,cell97:703-716,1999；loisandalvarez-buylla,proc.natl.acad.sci.usa90:2074-2077,1993；palmeretal.,
molcellneurosci8:389-404,1997；temple,nature414:112-117,2001】。
為了維持正常的大腦功能，神經元和膠質細胞的數值平衡是必要的。過去，在膠質細胞中占多數的星形膠質細胞被認為僅僅是神經元在執行功能時進行對其起到幫助的保護性細胞。然而，現在星形膠質細胞被認為除了作為結構性支持物，其還能影響神經元的周圍環境。亦即，星形膠質細胞分泌生長因子，從而調節神經元的功能，進而幫助維持血管與腦之間的屏障。此外，已知星形膠質細胞可通過直接調節神經元之間的結構形成和突觸功能來起更積極的作用。【nedergaardetal.,trendsneurosci26:523-530,2003；ullianetal.,science291:657-661,2001；songetal.,nature417:39-44,2002；templeanddavis,development120:999-1008,1994；serietal.,jneurosci21:7153-7160,2001；svendsen,nature417:29-32,2002】在病理上通過大量研究已知曉星形膠質細胞的功能上的重要性。當腦受損傷時，星形膠質細胞會積極地增殖而變得反應化，而且觀察到肥厚化。這種膠質細胞的積極增殖有利于促進組織在最初受損傷之后的盡快恢復并防止損傷的傳播。然而，當這種現象重復時，神經元的再生會受到抑制，引起炎癥反應，發生損傷，可導致退行性腦部疾病【myeretal.,brain129:2761-2772,2006；chenandswanson,jcerebbloodflowmetab23:137-149,2003；cunninghametal.,brian128:1931-1942,2005；faden,curropinneurol15:707-712,2002；katayamaetal.,jneurosurg73:889-900,1990】。
神經膠質增生(gliosis)是一種在各種中樞神經系統的病理過程中通常發生的現象，是由神經元受損引起的星形膠質細胞的過度增殖和激活造成的。當中樞神經系統受損時，正常的星形膠質細胞變得肥大，并形成能夠增加被稱為膠質纖維酸性蛋白(gfap)的中間絲蛋白的形成的反應性星形膠質細胞。受傷后，包括反應性星形膠質細胞的各種膠質細胞會過度增殖，從而形成叫作膠質瘢痕(glialscar)的堅硬的細胞層，其為治愈過程中的產物。這種神經膠質增生是在包括亨廷頓氏病、帕金森氏病和阿爾茨海默氏病的退行性腦部疾病、腦髓損傷以及如中風和腦腫瘤的中樞神經系統的各種病理現象中能夠觀察到的【faideauetal.,hummolgenet,2010；chenetal.,currdrugtargets,2005；rodriguezetal.,celldeathdiffer,2009；robeletal.,jneurosci,2011；talbottetal.,expneurol,2005；shimadaetal.,jneurosci；2012；sofroniewandvinters,actaneuropathol,2010】。
通常，神經膠質增生會根據最初受傷時的情況或受到創傷后所經過的時間而具有各種影響。受創傷后，初始的反應性星形膠質細胞會分泌神經生長因子如gdnf來防止細胞程序化死亡，引起對谷氨酸的收回，從而保護神經元。此外，所述初始的反應性星形膠質細胞在如恢復血腦屏障、隔離發生損傷的部位以及防止健康組織的感染中發揮積極的作用。然而，當受損后經過一定時間時，通過過度增殖的反應性星形膠質細胞形成膠質瘢痕，其像網一樣包住受傷部位，然后積累抑制細胞外基質。這種蛋白質的密集結構起到屏障的作用，而能夠防止神經元在物理和化學上進行再生及重建連接。此外，會分泌能夠誘發炎癥的物質和如細胞毒性細胞因子的神經毒性物質來引發神經元的凋亡，抑制功能性的恢復以及惡化病理癥狀。在現有技術中，中樞神經系統疾病是通過病理組織學檢查(histopathologicaltest)、電腦斷層掃描(ct)或核磁共振成像(mri)來進行檢測。然而，使用這些方法的診斷僅在疾病發展到一定程度后才可以實現。因此，有必要研發出一種能夠快速并準確地確認中樞神經系統疾病的進展的診斷標記。此外，在損傷前期能使神經元存活以及在后期能最大程度降低膠質瘢痕的生成并促進神經元的再生的治療方法是最佳的方法。
技術實現要素：
技術內容
本發明涉及通過確認fam19a5在調節膠質細胞生成的作用來提供fam19a5在診斷、預防或治療中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病中的醫藥用途。
技術方案
為了達到上述目的，本發明提供作為增殖或分化的調節劑的包含fam19a5(序列同源性19家族，成員a5)或其抑制劑的用于調節干細胞的增殖或分化的組合物。
本發明還提供用于診斷中樞神經細胞損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的組合物，該組合物包含用于測量fam19a5(序列同源性19家族，成員a5)基因的mrna或其蛋白質水平的劑型。
本發明還提供包含fam19a5(序列同源性19家族，成員a5)的用于治療早期創傷性腦損傷的組合物。
本發明還提供fam19a5在制備用于治療早期創傷性腦損傷的藥物組合物中的用途。
本發明還提供用于治療動物的早期創傷性腦損傷的方法，該方法包括將包含藥物有效劑量的fam19a5的用于治療早期創傷性腦損傷的組合物向受試者給藥的步驟。
本發明還提供包含fam19a5(序列同源性19家族，成員a5)抑制劑的用于預防或治療退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的組合物。
本發明還提供所述fam19a5抑制劑在制備用于預防或治療退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的藥物組合物中的用途。
本發明還提供用于治療動物的退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的方法，該方法包括向受試者給藥用于治療動物的退行性腦部疾病或中樞神經系統的組合物的步驟，該組合物包含藥物有效劑量的fam19a5抑制劑。
本發明還提供用于腦部疾病或中樞神經系統疾病的預防性或治療性藥物的篩選方法，該方法包括：在體外使fam19a5(序列同源性19家族，成員a5)基因與候選物質進行接觸；以及判斷所述候選物質能否促進或抑制所述基因的表達。
本發明還提供用于腦部疾病或中樞神經系統疾病的預防性或治療性藥物的篩選方法，該方法包括：在體外使fam19a5(序列同源性19家族，成員a5)蛋白質與候選物質進行接觸；以及判斷所述候選物質能否提高或抑制所述蛋白質的功能或活性。
有益效果
本發明發現，一種由神經干細胞分泌的蛋白質fam19a5能夠調節神經干細胞的增殖或分化，在腦脊髓受損傷時，其會過度表達，從而促進星形膠質細胞的形成，進而恢復早期受損組織，而在已受損的組織中用fam19a5特異性抗體中和fam19a5時，會抑制星形膠質細胞的形成。因此，fam19a5可用于診斷、預防或治療中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病。
附圖說明
圖1展示了從各種脊椎動物的fam19a5基因中表達的fam19a5肽的氨基酸序列(a)和系統發育樹(b)。
圖2展示了通過反轉錄聚合酶鏈反應(rt-pcr)的各種小鼠組織內的fam19a5家族基因的mrna表達模式(a)和每個發育階段的fam19a5家族基因的mrna表達模型(b)。
圖3展示了通過使用原位雜交(insituhybridization)在每個發育階段從腦室區和大鼠脊髓中測定fam19a5mrna表達而獲得的結果。
圖4展示了通過利用western印跡法(a)和免疫細胞化學(b)來確定fam19a5特異性抗體與his-fam19a5蛋白質的結合特性的結果。
圖5展示了通過利用免疫組織化學來測定在每個發育階段的小鼠的腦室區內fam19a5肽的表達而獲得的結果。
圖6展示了通過利用免疫組織化學來測定成年小鼠的腦室下區中神經干細胞和系統的損傷祖細胞內的fam19a5肽的表達(a)和在經分化條件下fam19a5肽的表達程度(b)的結果。
圖7展示了通過利用免疫細胞化學來測定小鼠的神經干細胞內所發育的神經球中的fam19a5肽的表達而獲得的結果。
圖8展示了通過測定神經球中fam19a5的表達而獲得的結果。(a)展示了通過免疫細胞化學所獲的結果，(b)展示了通過rt-pcr所獲的結果，以及(c)展示了通過微陣列所獲的結果。
圖9展示了通過利用免疫細胞化學(a)和western印跡法(b)來測定由fam19a5和其特異性抗體引起的神經干細胞的分化潛能的效果的結果。
圖10展示了通過測定由fam19a5和特異性抗體引起的神經干細胞的分化潛能的效果的結果。
圖11展示了通過利用免疫組織化學(ⅰ)和western印跡法(ⅱ)(a)、以及放射免疫分析法(b)來測定小鼠的創傷性腦損傷模型的血液中fam19a5蛋白質變化的結果。
圖12展示了創傷性腦損傷后通過測定隨時間的fam19a5蛋白質變化的結果。
圖13展示了通過利用免疫組織化學(a)、western印跡法(b)和放射免疫分析法
(c)來測定肌萎縮側索硬化癥模型中fam19a5蛋白質變化的結果。
圖14展示了創傷性腦損傷后用fam19a5特異性抗體處理時腦組織中的熒光信號。
圖15展示了創傷性腦損傷后用fam19a5特異性抗體處理時隨時間的細胞標記變化。
圖16展示了創傷性腦損傷后用fam19a5特異性抗體處理時的神經元的變化。
圖17展示了通過測定經fam19a5特異性抗體處理的小鼠的創傷性腦損傷模型中能夠表達fam19a5蛋白質的反應性星形膠質細胞的位置。
圖18展示了創傷性腦損傷后用fam19a5特異性抗體處理時測定ng2少突膠質祖細胞(a)和少突膠質細胞(b)的變化的結果。
具體實施方式
下面，將詳細地說明本發明的組成。
fam19a5(序列同源性19家族，成員a5)為由五個能夠編碼小分泌蛋白質的高度同源的基因組成的fam19a家族基因中的成員。這些蛋白質包含在固定位置上的保守的半胱氨酸殘基，而且與cc-趨化因子基因家族中成員mip-1α有關聯。已知，這些蛋白質主要在腦部和脊髓中進行特異性表達，而且在神經形成過程中由成體神經干細胞形成并分泌，而用作用來促進星形膠質細胞的形成的分化調節因子。
本發明人通過生物信息學分析方法(bioinformaticsapproach)利用原位雜交和免疫組織化學，發現了體內fam19a5的存在，通過免疫細胞化學確認了fam19a5在生成從神經干細胞中分化的細胞的過程中起的作用，并且檢測到其在脊椎動物中與神經元和膠質細胞生成有關的多種疾病的治療用途，從而完成本發明。
因此，本發明提供用于調節增殖或分化干細胞的組合物，該組合物包含作為增殖或分化調節劑的fam19a5(序列同源性19家族，成員a5)。
根據本發明的一個具體實施例，fam19a5在脊椎動物的腦中特異性表達，其在腦室區和脊髓區域內分布最多，處于生出生前的孕期中的胎兒的腦室區和腦室下區中高度表達，然而分化有神經元的皮質板中弱表達。因此，本發明首次證明了fam19a5基因在已知具有神經干細胞群的中樞神經系統中的兩個區域內強烈表達，對完整的中樞神經系統的形成有重要作用，并且參與組成中樞神經系統的神經元和膠質細胞的形成。
基于這些結果，觀察了fam19a5在從神經干細胞中生成的神經球內的表達。其結果可見，fam19a5在神經球內的分布要比fam19a5家族基因的其他類型更多。這表明，在成體和胚胎神經干細胞的功能中及在從所述干細胞生成的細胞向不同類型分化的過程中，fam19a5可能是一種重要的肽。
通過這些結果，可判斷出，fam19a5是從神經干細胞中形成并分泌出來的，而且影響細胞(即神經元或星形膠質細胞)的形成及其分化。由此可知，fam19a5能夠促進星形膠質細胞的形成。
因此，fam19a5可通過其數量上的量變來調節從神經干細胞分化的神經元或星形膠質細胞的數量。亦即，由于可通過增加fam19a5數量來增加已分化星形膠質細胞的數量，而且可通過降低fam19a5數量來增加已分化神經元的數量，從而可知fam19a5為分化調節因子。
此外，根據本發明的另一個具體實施例，確定了可通過增加fam19a5數量來降低神經干細胞的增殖，并且可通過降低fam19a5數量來增加神經干細胞的增殖。由此可知，fam19a5為干細胞的增殖調節因子。
因此，fam19a5或其抑制劑可用作干細胞增殖或分化的調節劑。
本發明的fam19a5為從神經干細胞中分泌出來的分泌蛋白質，其包含基因序列，該基因序列編碼作為向細胞外分泌的信號的氨基末端的典型的信號肽，隨后具有成熟fam19a5的氨基酸序列(參照圖1)。
本發明的用于調節干細胞的增殖或分化的組合物可包含天然或重組fam19a5、與之具有實質上等同的生理活性的fam19a5蛋白質、過度表達所述天然或重組fam19a5的轉基因神經干細胞，或fam19a5抑制劑。所述具有實質上等同的生理活性的蛋白質包含天然/重組fam19a5、其功能性等同物和功能性衍生物。
所述術語“功能性等同物”是指部分或全部的天然蛋白質的氨基酸被置換或部分氨基酸被刪除或添加的氨基酸序列變異體，而且與天然fam19a5具有實質上等同的生物活性。
所述術語“功能性衍生物”是指經修飾的蛋白質，其能增強或降低所述fam19a5蛋白質的物理和化學性質，而且與天然fam19a5具有實質上等同的生物活性。
根據一個具體實施例，本發明中所用的fam19a5可從基因庫編號nm_134096、nm_001191991等，通過本領域的技術人員所熟知的遺傳工程方法制備而成的。
當通過基因重組方法制備蛋白質而獲得天然fam19a5時，如果使用哺乳動物細胞而非大腸桿菌或昆蟲細胞，則認為其在所述蛋白質的活性或溶解程度上與所述天然類型更為類似。
通過利用常用的柱層析法分離所述重組fam19a5蛋白質。所述蛋白質的提純程度可通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)來檢測。
所述能夠過度表達天然或重組fam19a5的轉基因神經干細胞是通過常規方法將能夠表達天然或重組fam19a5的載體導入神經干細胞內來制成的。
所述fam19a5抑制劑可以為反義寡核苷酸、sirna、shrna、mirna或包含其的載體，或者抗體中的任一種。
當體外培養神經干細胞時，可添加本發明的用于調節增殖或分化干細胞的組合物，作為增殖或分化調節因子。例如，在進行誘導增殖或分化的神經干細胞培養時，添加天然或重組fam19a5、或者其抑制劑，以通過天然或重組fam19a5、或者其抑制劑的數量變化來調節干細胞增殖的增加或降低，或者以調節神經元或星形膠質細胞的數量。
此外，將神經干細胞和能夠過度表達天然或重組fam19a5的轉基因神經干細胞一同培養來誘導分化時，由于從轉基因和正常神經干細胞中所分泌的fam19a5蛋白質的量在增加，因此星形膠質細胞的數量將會增加。
除了fam19a5外，本發明的用于調節干細胞增殖或分化的組合物可進一步包括已知的分化誘導因子，該分化誘導因子能夠誘導神經干細胞的分化。例如，可使用睫狀神經營養因子(cntf)、骨形態發生蛋白(bmps)、轉化生長因子(tgfα)、或神經調節蛋白-1(nrg1)/神經膠質細胞生長因子-2(ggf2)。
本發明還提供用于診斷中樞神經系統創傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的組合物，該組合物包含用于測量fam19a5(序列同源性19家族，成員a5)基因的mrna表達或蛋白質濃度的制劑。
當腦部受到損傷，成熟的星形膠質細胞能夠積極增殖，成為反應性星形膠質細胞，變肥大，誘導組織迅速恢復，而且預防損傷的蔓延。
根據本發明的一個具體實施例，受損區域內的fam19a5表達會顯著提高，在受損區域內的放射狀膠質細胞會表達作為標記的巢蛋白，同時能夠表達fam19a5，而且與未受損的對照組相比數量有明顯增加。此外，從腦室下區通過胼胝體遷移至腦損傷區域的成神經細胞幾乎不表達fam19a5。除了所述受損區域外，在神經干細胞群所在的腦室下區的外圍區域內，能夠表達fam19a5蛋白質的細胞的數量有增加，而且這些會同時表達作為星形膠質細胞的標記的gfap。
此外，在腦創傷后血腦屏障受損時，fam19a5可滲進血液中。可通過血檢確認fam19a5的存在與否。待腦創傷之后，這種表達量會隨著時間趨于持續增加。
根據本發明的另一個具體實施例，在作為脊髓損傷疾病模型的肌萎縮側索硬化癥中測量fam19a5蛋白質濃度的量變。結果，可確認所述表達量較普通模型有增加。
因此，fam19a5可用作用來診斷中樞神經系統損傷的生物標記。
此外，根據本發明的另一具體實施例，將fam19a5特異性抗體用來治療由創傷性腦損傷而生成的反應性星形膠質細胞時，可抑制那些星形膠質細胞的過度增殖，神經元會生存下來，因此可預期，從長遠來看，會促進受損區域的神經元的再生。因此，fam19a5可用來客觀并定量地診斷由中樞神經系統損傷引起的疾病的進展。
因此，fam19a5可用作生物標記，用來診斷由中樞神經系統損傷引起的退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病。
本說明書中使用的術語“中樞神經系統損傷”包括能夠引起腦脊髓細胞的破壞或退化的所有種類的中樞神經系統損傷。例如，外傷性腦損傷、肌萎縮側索硬化癥等，但所述損傷不限于此。
所述術語“退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病”是指，由中樞神經系統損傷導致的神經膠質增生引起的退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病。這種疾病的例子包括阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、帕金森氏病、中風或腦腫瘤，但該疾病不限于任何具體的疾病種類。
所述術語“診斷”是指，病理狀態的確定。鑒于本發明的目的，所述診斷是指，測定fam19a5表達作為中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的診斷標記，以確認中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病和中樞神經系統疾病的發病、進展及緩解。
所述術語“診斷標記”是指，能夠從普通細胞中分別診斷出中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的細胞的物質，其包括有機生物分子，如多肽或核酸(如mrna)、脂質、糖脂、糖蛋白以及糖(單糖、二糖、寡糖等)，這些在中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的細胞中比起正常細胞有增加或減少。本發明所提供的用于中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的診斷標記可以為蛋白質，該蛋白質是由fam19a5基因表達的，而且fam19a5基因在中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的細胞中的表達較正常細胞有增加。
本發明的用于診斷中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的組合物，包含用來測量fam19a5基因的mrna表達水平或其蛋白質表達量的制劑。這種制劑可包括，例如，具有與fam19a5mrna互補的序列的寡核苷酸，與fam19a5mrna特異性結合的引物或核酸探針，以及fam19a5蛋白質特異性抗體。
所述引物是指，在適當的溫度和緩沖液中并在適當條件(即，不同的核苷三磷酸和聚合酵素的四種類型)下可用作模板導向dna合成的起始點的單鏈寡核苷酸。所述引物的合適長度可因各種因素，如溫度和所述引物的用途，而有變化。此外，所述引物的序列不需要具有與所述模板序列完全互補的序列。在序列可雜交并所述引物可完成其功能的范疇內所述序列具有充分的互補性就足夠了。因此，本發明的引物不需要具有與作為模板的基因的核苷酸序列完全互補的序列。在序列可雜交并所述引物可完成其功能的范疇內所述序列具有充分的互補性就足夠了。此外，本發明的引物可優選地用于基因擴增反應。所述擴增反應是指，能夠擴增核酸分子的反應。這種基因的擴增反應在本領域內已被廣泛知曉，其可包括，如聚合酶鏈反應(pcr)、逆轉錄聚合酶鏈反應(rt-pcr)、連接酶鏈反應(lcr)、轉錄介導的擴增(tma)和基于核酸序列的擴增(nasba)。
所述核酸探針是指天然或變形的單體或線性連接的低聚物，包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，其能夠與靶核苷酸序列特異性雜交，而且會自然產生或被人工合成。本發明的探針可以為單鏈，優選為寡脫氧核苷酸(oligodeoxyribonucleotide)。本發明的探針可以包括天然dnmp(即，damp、dgmp、dcmp和dtmp)、以及核苷酸類似物或衍生物。此外，本發明的探針可包括核糖核苷酸(ribonucleotide)。例如，其可包括：經骨架修飾的核苷酸，例如肽核酸(pna)(m.egholmetal.,nature,365:566-568(1993))、硫代磷酸酯dna、二硫代磷酸酯dna、磷酰胺酯dna、酰胺連接的dna、mmi連接的dna、2'-o-甲基rna、α-dna和甲基膦酸dna；經糖修飾的核苷酸，例如2'-o-甲基rna、2'-氟rna、2'-氨基rna、2'-o-烷基dna、2'-o-烯丙基dna、2'-o-炔基dna、己糖dna、吡喃糖rna和失水己糖醇dna；以及，具有堿基變異的核苷酸，例如c-5取代嘧啶(取代基包括氟代、溴代、氯代、碘代、甲基、乙基、乙烯基、甲酰基、ethnyl-、丙炔基、炔基、噻唑基、咪唑基和吡啶基)、具有c-7取代基的7-脫氮嘌呤(取代基包括氟代、溴代、氯代、碘代、甲基、乙基、乙烯基、甲酰基、炔基、烯基、噻唑基、咪唑基和吡啶基)、肌苷和二氨基嘌呤作為fam19a5特異性抗體，可使用多克隆抗體、單克隆抗體、人抗體和人源化抗體。
所述抗體片段的例子包括：fab、fab'、f(ab')2和fv片段；雙特異抗體(diabody)；線性抗體(zapataetal.,proteineng.8(10):1057-1062(1995))；單鏈抗體分子；和從抗體片段中形成的多特異性抗體等。
當用木瓜蛋白酶分解抗體時，形成兩個相同的抗原結合片段，即具有單個抗原結合位點的“fab”片段和余下的“fc”片段。當用胃蛋白酶進行處理時，形成具有兩個抗原結合位點且仍能與所述抗原交聯的f(ab')2片段。fv為包括完整的抗原識別和結合區的小抗體片段。該區由一個重鏈與一個輕鏈可變區的二聚物組成，并緊緊地通過非共價鍵偶聯。
用于制備多克隆抗體的方法對本領域的技術人員來說是熟知的。多克隆抗體可通過向哺乳動物注射一次或多次免疫劑來制備的，而且根據需要，同時可注射免疫佐劑。通常，向哺乳動物的皮下或腹膜內注射多次免疫劑和/或免疫佐劑。所述免疫劑可以為本發明的蛋白質或其融合蛋白。當向哺乳動物一同注射已知有免疫原性的蛋白質和免疫劑來進行免疫化時，可能會有效。
本發明的單克隆抗體可通過如文獻(kohleretal.,nature,256:495(1975))中所記載的雜交方法進行制備，或通過重組dna方法(如，參zao照美國專利號4,816,576)進行制備。例如，所述單克隆抗體還可通過利用如文獻(clacksonetal.,nature,352:624-628(1991)andmarksetal.,j.mol.biol.,222:581-597(1991))中所述的技術從噬菌體抗體庫中分離而出。
只要能夠展示期望的活性，本發明的單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的部分與源自特定物種的相應抗體或屬于特定抗體類或抗體亞類的相應抗體具有相同或同源的序列，而所述鏈的余下部分具有源自不同物種的抗體或屬于不同抗體類或抗體亞類的抗體，或者與此抗體的片段相同或同源(morrisonetal.,proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855(1984))。
非人(如，鼠科(murinae))抗體的“人源化”種類包括源自非人免疫球蛋白的具有最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如，fv、fab、fab'、f(ab')2或抗體的其他抗原結合序列)。在多數情況下，所述人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的互補決定區(cdr)的殘基被具有期望的特異性、親和度和能力的如大鼠、小鼠或兔的非人物種(供體抗體)的cdr殘基所取代。在一些情況下，人免疫球蛋白的fv框架殘基被相應的非人殘基所取代。此外，所述人源化抗體可包括受體抗體、或在導入有cdr或框架的序列中未被發現的殘基。通常，所述人源化抗體實際上包括至少一種可變結構域，一般包括兩種或以上的可變結構域。其中，所有的或實質上所有的cdr區相對應于所述非人免疫球蛋白的區域，而且所有的或實質上所有的fr區相對應于人免疫球蛋白序列的區域。此外，所述人源化抗體包括免疫球蛋白恒定區(fc)的至少一部分，通常包括人免疫球蛋白區的一部分(presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992))。
本發明的用于診斷中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的組合物可以為包含于試劑盒的形式。
所述試劑盒可包含用來測量fam19a5基因的表達水平或蛋白質的量的所述引物、探針或抗體。對其的定義與如上所述的內容相同。
當所述試劑盒應用于pcr擴增過程中時，pcr擴增所必要的試劑可有選擇地包括，如緩沖液、dna聚合酶(如，從thermusaquaticus(taq)、thermusthermophiles(tth)、thermusfiliformis、thermisflavus、thermococcusliteralis或pyrococcusfuriosus(pfu)中獲得的熱穩定性dna聚合酶)、dna聚合酶輔助因子和dntp。但所述試劑盒應用于免疫分析時，其可有選擇性地包括二抗和做標記的底物。進一步，本發明的試劑盒可制成能夠包含上述試劑化合物的多個單獨的包裹或隔室(compartment)。
此外，本發明的用于診斷中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的組合物可以為包含于微陣列的形式。
此外，本發明的用于診斷中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的組合物可以為包含于微陣列的形式。
在本發明的微陣列中，用于測量所述fam19a5蛋白質或編碼該蛋白質的基因的引物、探針或抗體用作可雜交的陣列要素并被固定于底物上。優選底物可包括適當的堅固性或非堅固性支撐物，如膜、過濾器、芯片、幻燈片、晶片、光纖、磁珠或非磁性珠、凝膠、管子、板、聚合物、微粒或毛細管。所述可雜交的陣列要素被排列并固定于所述底物上。這種固定可通過化學結合方法或利用uv的共價方法來進行。例如，所述可雜交的陣列要素可與被修飾而包含環氧化合物或醛基的玻璃表面進行偶聯，或可與利用uv的多聚賴氨酸涂層表面進行偶聯。此外，所述可雜交的陣列要素可通過接頭(如，乙二醇低聚物和二胺)與所述底物進行偶聯。
同時，當應用于本發明的微陣列的樣品為核苷酸時，所述樣品可被標記并于所述微陣列上的陣列要素進行雜交。雜交條件可多種多樣，而且雜交程度的檢測和分析可根據標記物質多樣化地進行。
此外，本發明提供用于診斷中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的方法，該方法利用了測量所述fam19a5基因或蛋白質的表達水平的方法，更為具體地，所述方法包括：(a)從疑似患有中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的患者的生物樣品中測量fam19a5基因的表達水平或所表達的蛋白質的量；及(b)從正常對照組樣品中測量基因的表達水平或所表達的蛋白質的量，并將其結果與(a)測量結果進行對比。
如上所述的用于測量基因的表達水平或所表達的蛋白質的量的方法可公知技術，其包括從生物樣品中分離出mrna或蛋白質的已知過程。
所述生物樣品是指，從中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的發病或進展程度與正常對照組進行對比時具有不同的基因或蛋白質表達水平的生物體中收集的樣品。所述樣品的例子可包括組織、細胞、血液、血清、血漿、唾液和尿，但不限于此。
當測量所述基因的表達水平時，優選會測量mrna的水平。作為測量mrna的水平的方法可使用rt-pcr、實時rt-pcr、核糖核酸酶保護分析法、northern印跡法、dna芯片等，但不限于此。
當測量所述蛋白質水平時，可使用抗體。此時，生物樣品中的fam19a5蛋白質和其特異性抗體可形成結合物(conjugate)，即抗原-抗體復合物。所形成的抗原-抗體復合物的量可通過由檢測標記產生的信號的大小進行定量測定。此檢測標記可選自酶、熒光物質、配體、發光物質、微粒、氧化還原分子或放射性同位素，但不限于此。用于測定蛋白質水平的分析方法包括western印跡法、elisa、放射免疫分析法、放射免疫擴散法、ouchterlony免疫擴散法、火箭免疫電泳、組織免疫染色、免疫沉淀分析法、補體結合分析法、facs、蛋白質芯片等，但不限于此。
因此，通過利用所述檢測方法，本發明可確定對照組中表達的mrna或蛋白質的量、以及疑似患有中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的患者中表達的mrna或蛋白質的量。然后，可互相對比所述結果，以診斷中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的發病、進展程度等。
此外，在本發明的用于診斷中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的方法中，當本發明的fam19a5基因的表達水平或所表達的蛋白質的量與所述正常對照組樣品相比有增加時，可判斷中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的存在。
本發明還涉及用于治療早期創傷性腦損傷的組合物，該組合物包含fam19a5(序列同源性19家族，成員a5)。
本發明還涉及fam19a5在制備用于治療早期創傷性腦損傷的藥物組合物中的用途。
由于創傷性腦損傷而受傷后形成的初始的反應性星形膠質細胞會分泌能夠防止細胞程序化死亡的神經生長因子，如gdnf，并恢復對谷氨酸的收回來保護神經元。此外，所述星形膠質細胞可通過恢復血腦屏障、隔離發生損傷的部位以及防止健康組織的感染來起到有益作用。
由于從神經干細胞中形成的fam19a5會參與到星形膠質細胞的形成，而非神經元的形成，fam19a5可促進腦損傷區域中的星形膠質細胞的形成，以治療早期創傷性腦損傷并抑制腦損傷疾病的進展。
因此，fam19a5可用作用來治療早期創傷性腦損傷的制劑。
本發明的用于治療早期創傷性腦損傷的組合物可包含天然或重組fam19a5蛋白質、與其具有事實上等同的生理活性的fam19a5蛋白質、能夠過度表達fam19a5蛋白質的轉基因神經干細胞或從所述神經干細胞中分化出的星形膠質細胞中的至少一種。對其的定義與如上所述的內容相同。所述天然或重組fam19a5蛋白質或與其具有事實上等同的生理活性的fam19a5蛋白質能夠促進腦損傷區域中的星形膠質細胞的形成，以治療早期創傷性腦損傷。
此外，向腦組織直接注射所述能夠過度表達fam19a5蛋白質的轉基因神經干細胞，在腦損傷區域中分泌出fam19a5蛋白質，以促進星形膠質細胞的形成，或者促進從轉基因神經干細胞到星形膠質細胞的轉化，以治療早期創傷性腦損傷。此時，為了促進所述轉基因神經干細胞的分化，可并行給藥分化誘導因子。分化誘導因子的種類與如上所述的內容相同。
將從神經干細胞分化的星形膠質細胞直接注射到腦組織時，在腦損傷區域中存在大量的星形膠質細胞，從而可治療早期創傷性腦損傷。
此外，本發明提供用于治療動物的早期創傷性腦損傷的方法，其包括：向受試者給藥用于治療早期創傷性腦損傷的組合物，該組合物包含藥物有效劑量的fam19a5。
下面將描述用于治療早期創傷性腦損傷的藥物組合物和在用于治療早期創傷性腦損傷的方法中用到的給藥方法，為了避免使本說明書過于復雜而省略多余的描述。
可給藥所述用于治療早期創傷性腦損傷的藥物組合物的受試者包括所有動物，如狗、貓和鼠。
本發明還涉及用于預防或治療退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的組合物，該組合物包含fam19a5(序列同源性19家族，成員a5)抑制劑。
本發明還涉及fam19a5抑制劑在制備用于預防或治療退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的藥物組合物中的用途。
由于fam19a5促進作為膠質細胞之一的星形膠質細胞的形成，在表達出大量膠質細胞的退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病中抑制fam19a5mrna或蛋白質的表達時，由于fam19a5阻礙而使反應性星形膠質細胞的數量有減少，然而會促進能夠表達ng2(神經元-膠質抗原2)的祖細胞的增殖，腦損傷區域附近的神經元的軸突是有髓鞘的，從而fam19a5抑制劑可用來治療退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病。
因此，本發明的用于預防或治療退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的組合物可包含用來降低fam19a5基因的mrna表達或其蛋白質表達、或者功能或活性的制劑。
所述fam19a5蛋白質抑制劑可以為與fam19a5蛋白質相結合并能夠調節神經分化通路的信號的肽或化合物。此抑制劑可通過如蛋白質結構分析的以下示例性篩選方法來進行選取，而且可通過利用本領域的公知方法進行設計。
此外，所述蛋白質抑制劑可使用相對fam19a5蛋白質的多克隆抗體、單克隆抗體、人抗體和人源化抗體，而且所述抗體的定義與如上所述的內容相同。
當通過利用抗體來調節細胞中受體的神經分化通路的信號轉導時，可預防或治療退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病。
本發明的fam19a5蛋白質的功能或活性抑制劑可通過脂質體、病毒、基因槍、聚合物、超聲波或電擊來進行轉達，當該轉達方法不限于此。
所述fam19a5基因可以為能夠編碼該基因的dna或從其中轉錄得到的mrna。因此，所述基因的抑制劑可以為與所述基因本身相結合來阻止轉錄、或與從所述基因轉錄得到的mrna相結合來防止所述mrna的翻譯的抑制劑。
因此，所述fam19a5基因的抑制劑包括能夠抑制fam19a5基因表達的所有抑制劑。例如，這種抑制劑可以為與所述基因相結合的肽、核酸、化合物等。所述抑制劑可通過如基于細胞的篩選的以下示例性篩選方法來進行選取，而且可通過利用本領域的公知方法進行設計。
在一個具體實施例中，所述抑制劑可以為fam19a5基因的反義寡核苷酸、sirna、shrna、mirna或包含這些的載體。可利用本領域的公知方法來制備這種反義寡核苷酸、sirna、shrna、mirna或包含這些的載體。
在本發明中，術語“sirna”是指通過切斷靶基因的mrna來誘導rna干擾的雙鏈rna分子，其由與所述靶基因的mrna具有相同序列的正義序列的rna鏈及具有與其互補序列的反義序列的rna鏈組成。
所述sirna可包含在體外合成的sirna本身或通過在表達載體中插入能夠編碼sirna的序列來進行表達的形式。
在本發明中，術語“載體”是指包含被插入到能夠編碼多肽的基因組中的外部dna的基因構建。
本發明所涉及的載體為在基因組中插入能夠抑制所述基因的核酸序列的載體。例如，載體可包括dna載體、質粒載體、粘粒載體、噬菌體載體、酵母載體或病毒載體。
此外，所述反義鏈具有與所述fam19a5基因、或從其片段中轉錄得到所有或部分mrna序列互補的序列，并與所述mrna相結合，而抑制所述fam19a5基因或其片段的表達。
此外，短發夾rnai(shrnai)是可利用普通方法通過靶向人或鼠的相同shrnai序列區來制備而成的。
此外，除了所述fam19a5抑制劑之外，本發明的用于預防或治療退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的組合物可進一步包含胚胎神經干細胞或成體神經干細胞。由于所述fam19a5抑制劑能夠調節同時使用的神經干細胞的增殖和分化，其可促進有助于組織恢復的神經元的形成，從而對退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的治療進一步得到改善。
本發明還提供用于治療動物的退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的方法，該方法包括：向受試者給藥用于預防或治療退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的組合物，該組合物包含藥物有效劑量的所述fam19a5抑制劑。
由于用于治療早期創傷性腦損傷的藥物組合物和在用于治療退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的方法中用到的給藥方法已在上面描述，為了避免使本說明書過于復雜而將省略多余的描述。
同時，可給藥所述用于預防或治療退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的藥物組合物的受試者可包括所有動物，例如非人的動物，如狗、貓和鼠。
此外，本發明的醫藥組合物可進一步包含藥學上可接受的載體(carrier)。
所述藥學上可接受的載體(carrier)包含在醫藥領域中常用的載體或媒介物(vehicle)，具體地其包括離子交換樹脂、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(如，人血清白蛋白)、緩沖物質(如，各種磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀和飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物)、水、鹽類或電解質(如，硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉和鋅鹽)、膠體二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素底物、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚芳酯、蠟、聚乙二醇、羊毛脂等，但不限于此。
此外，除了上述化合物之外，本發明的組合物可進一步包含潤滑劑、潤濕劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。
在一方面，本發明的組合物可使用用于腸胃外給藥的水溶液來制成。優選地，可使用漢克氏溶液、林格氏溶液或如物理緩沖鹽溶液的緩沖液。作為水注射懸浮液，可包括能夠提高所述懸浮液粘度的底物，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。
本發明的組合物可全身或局部給藥，而且可通過利用用于制劑的公知技術來制成適當的劑型。例如，當口服給藥所述組合物時，所述組合物可與惰性稀釋劑或可食用載體進行混合，并密封在硬的或軟的明膠膠囊內，或壓成片劑，然后進行給藥。在口服給藥中，所述活性化合物可與賦形劑進行混合，并以攝入型片劑、含片、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮劑、糖漿、晶片等的形式進行使用。
各種用于注射、胃腸外給藥等的劑型可通過本領域中公知技術或常用技術進行制成。由于fam19a5易溶于生理鹽水或緩沖液，將fam19a5保存在冷凍干燥狀態下，然后在給藥前立即將有效劑量的fam19a5以靜脈內注射、皮下注射、肌內注射、腹腔內注射、經皮給藥等適當的給藥形式在生理鹽水或緩沖液中進行制劑。
本發明的醫藥組合物的活性成分的有效劑量是指，預防、抑制或緩解疾病所必要的量。
因此，可根據各種因素，如疾病種類、疾病的嚴重程度、包含于所述組合物中的活性成分和其它組分的種類及含量、制劑種類、患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥時間、給藥途徑、所述組合物的分泌速率、治療期間以及同時被患者所使用的藥品，來調節所述有效劑量。例如，當向成人一天給藥一次或多次，而且本發明的抑制劑一天給藥一次或多次時，可給藥0.1ng/kg～10g/kg的化合物、0.1ng/kg～10g/kg的多肽、蛋白質或抗體、以及0.01ng/kg～10g/kg的反義寡核苷酸、sirna、shrnai或mirna，但不限于此。
本發明還提供用于腦部疾病或中樞神經系統疾病的預防性或治療性藥物的篩選方法，該方法包括：在體外使fam19a5(序列同源性19家族，成員a5)基因與候選物質進行接觸，并且判斷所述候選物質能否促進或抑制所述基因的表達。
本發明還提供用于腦部疾病或中樞神經系統疾病的預防性或治療性藥物的篩選方法，該方法包括：在體外使fam19a5(序列同源性19家族，成員a5)蛋白質與候選物質進行接觸，并且判斷所述候選物質能否提高或抑制所述蛋白質的功能或活性。
根據本發明的篩選方法，首先，將待分析的候選物質與包含所述基因或蛋白質的腦部疾病或中樞神經系統疾病的細胞進行接觸。
根據傳統的選取方法，所述候選物質可包含，能夠促進或抑制在fam19a5基因序列中轉錄成mrna和翻譯成蛋白質的物質、被推測具有能夠促進或抑制fam19a5蛋白質的功能或活性的醫學上應用的可能性的物質、或隨機選取的單個的核酸、蛋白質、肽、其它提取物、天然產物、化合物等。
然后，在處理候選物質的細胞中可測量基因表達的量、蛋白質的量或蛋白質的活性。在所測結果中，當測到基因表達的量、蛋白質的量或蛋白質的活性有增加或降低時，可判斷所述候選物質為能夠治療或預防腦部疾病或中樞神經系統疾病的物質。
在如上所述中，可通過各種本領域內公知的方法對所述基因表達的量、蛋白質的量或蛋白質的活性進行測量，如rt-pcr、實時聚合酶鏈反應、western印跡法、northern印跡法、酶聯免疫吸附試驗(elisa)、放射免疫分析(ria)、放射免疫擴散法、免疫沉淀法等，但不限于此。
通過本發明的篩選方法，可獲得展示出能夠促進基因表達或促進蛋白質功能的候選物質、以及反之展示出能夠抑制基因表達或抑制蛋白質功能的候選物質。前者可以為用于早期創傷性腦損傷的治療制劑。后者可以為用于退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的治療制劑。
用于退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的治療制劑候選物質可在后期的用于退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的治療制劑的研發過程中起到主導化合物的作用。當對所述主導化合物的結構進行變形和最優化以促進或抑制fam19a5基因或從其中表達出的蛋白質的功能時，可研發出一種新型的用于退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的治療制劑。
在本發明中，與基因工程技術有關的內容可從sambrook(sambrook,etal.molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2001))andfrederick(frederickm.ausubeletal.,currentprotocolsinmolecularbiologyvolume1,2,3,johnwiley&sons,inc.(1994))一書所公開的內容中得到清晰的理解。
實施例
本發明的優勢和特點及達到這些的方法將根據具體說明的實施例而得到清晰的理解。然而，本發明不受以下所公開的實施例的限制，然而可以不同形式進行實現。所述實施例僅用來完整地公開本發明并向本領域的技術人員完整地告知本發明的范圍，而且本發明由所附的權利要求所限定。
<實施例1>通過利用生物信息學發現的新型分泌性fam19a5肽通過生物信息學方法模型(bioinformaticsapproachmodel)，進行fam19a5基因篩選作業。本發明人從ensembl(http://www.ensembl.org/index.html)和uniprotkb(http://www.uniprot.org/uniprot)上下載了約50,000種人基因組基因的開放閱讀框架(openreadingframes，orfs)。為了識別其中是否存在具有可能為生理活性肽的基因，用signalp3.0程序在約2,000種從細胞分泌出來的基因(分泌蛋白質組)中進行篩選。基于uniprotkb信息，分析經篩選的orfs。其結果顯示，約600種orfs確認為能夠編碼肽的基因(peptidome)。其中，560種基因的功能已被知曉，然而余下40種基因，還尚未發現其功能，而且其可編碼新的肽。
其中，在包括人在內的各種脊椎動物中發現了fam19a5基因。fam19a5包含能夠編碼作為信號向細胞外分泌的具有氨基端的典型信號肽的基因序列，緊接著包含成熟fam19a5的氨基酸序列。尤其，與其他種類相比，fam19a5蛋白質的氨基酸序列保存完好(圖1a)。上述比較基因組分析方法被認為是能夠驗證新發現的新型基因是否具有實質性功能的可信的實驗模型【robbins,jcomputbiol3:465-478,1996】。同時，根據現有技術文獻的結果，在有一篇論文中確認了在患有老年癡呆癥的腦組織中大量表達cc趨化因子基因并分析了作為cc趨化因子家族基因的mip-1α能夠增殖膠質細胞并惡化退行性腦部基因的經驗證的機制，然而系統發育樹(圖1b)展示了，fam19a家族基因形成與所述cc趨化因子家族基因完全不同的分支【mengqidiaetal.,americanjournalofpathology,1998】。
<實施例2>通過反轉錄聚合酶鏈反應(rt-pcr)驗證各種組織中fam19a5基因表達從daehanbiolink株式會社(http://www.dhbiolink.com)購買6周齡黑色雄性小鼠(c57bl/6，小鼠)。購買的小鼠在鼠籠里進行飼養，在該鼠籠內有供應適當的食物和水，溫度維持在20～24℃，濕度保持在40～70％。此外，在12/12光暗周期(上午八點開燈，下午八點關燈)內保管這些野生型的小鼠。所有實驗被設計成均使用最少數量的小鼠，根據動物實驗倫理，實施了麻醉方法，以最大程度降低實驗中所用的小鼠的痛苦，而且此項已被高麗大學的動物管理和使用委員會所核準(kuiacuc-08)。
從小鼠中提取每個對應組織中所有rna，然后通過使用逆轉錄酶和隨機六聚體來制備互補dna(cdna)。隨后，通過利用相應的引物進行聚合酶鏈反應(pcr)，并觀察小鼠組織的mrna分布。將pcr中所用的引物的信息列在表1中。
如圖2所示，除了fam19a3基因外，所有類型的fam19a家族基因均進行腦特異性表達。此外，甚至在早期發育階段也觀察到fam19a家族基因的表達。
【表1】
<實施例3>通過原位雜交的每個發育階段驗證fam19a5基因表達
為了確定在發育過程中大腦皮層中的fam19a家族基因的表達模式，利用原位雜交來對比
mrna的量。用與上述方法相同的方式管理wistar大鼠。處死(斷頭)了出生前胚胎期14
(e14)、出生后過21天的大鼠而從其顱骨中取得腦。由于出生前的大鼠比起作為其他類型
實驗大鼠的小鼠具有更大體型，在所述實驗中所述大鼠便于處理而被用來對比每個發育階段的fam19a5基因表達。
提取的腦移至并冷凍在干冰上的異戊烷溶液中。將冷凍腦組織以12μm進行切片，貼(解凍放置)于涂有tespa(sigma-aldrichco.,llc.,st.louis,mo,usa)的載玻片上，然后在包含4％多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(pbs)中進行固定。然后，通過使用包含0.25％乙酸酐的0.1m的三乙醇胺/0.9％nacl(ph8.0)中進行乙酰化反應。然后，使用乙醇和氯仿溶液來進行脫水和脫脂過程，隨后在空氣中干燥。同時，在55℃下利用35s標記的探針對切片組織進行雜交，而后在常溫下用2×ssc溶液清洗。用rna降解酶(rna酶)處理所述片，然后在常溫下依次用包含1mm二硫蘇糖醇的2×ssc、1×ssc、0.5×ssc、0.1×ssc溶液清洗所述片，各清洗十分鐘。最后，將所述組織切片進行脫水并在空氣中干燥，然后將包含腦組織切片的載玻片暴露于x射線片(biomaxmr,eastmankodakco.,rochester,ny,usa)。
同時，為了生成探針，從成年大鼠的大腦皮層中提取所有rna，通過利用逆轉錄酶和隨機六聚體引物來制備cdna，然后進行t載體(promegacorp.,madison,wi,usa)的克隆。將pcr中所用的引物的信息列在表2中。將克隆t載體用作模板，用[35s]utp(amershampharmaciabiotechinc.,piscataway,nj,usa)執行體外轉錄體系(promegacorp.,madison,wi,usa)，然后純化生成放射性標記的反義核糖核酸探針，用于本雜交反應中。
【表2】
從嗅球所在的嘴側至小腦所在尾側，沿整體冠狀面和矢狀面，來掃描所述小鼠腦的解剖平面。
如圖3所示，在fam19a家族基因的mrna表達中，只有fam19a5mrna強分布于腦室區和脊髓中。在出生前胚胎期第14天(e14)和16天(e16)時，fam19a5僅僅強分布于腦室區中。在胚胎期第18天(e18)時，腦室區和腦室下區中的fam19a5的表達仍高，而在包含分化的神經元的皮質板中fam19a5的表達則低得多。
fam19a5在已知有神經干細胞群分布的中樞神經系統中的兩個區域內強表達。這表明，fam19a5蛋白質對完整的中樞神經系統的形成起重要作用，而且能夠首次證明，fam19a5蛋白質可參與組成中樞神經系統的神經元和膠質細胞的形成當中。
<實施例4>fam19a5特異性抗體的制備為了制備能夠特異性地識別fam19a5蛋白的抗體，將短的合成fam19a5接種于兔子上以獲得多克隆抗體。在hek293t細胞中過度表達的fam19a家族基因中，所述抗體只能特異性地識別fam19a5(圖4a左欄)。此外，當用n-糖苷酶f處理后，作為fam19a5的成熟蛋白質的20kda帶會消失掉，由此確認其為n-糖基化形式(圖4a右欄)。此外，通過利用免疫細胞化學來觀察，每個抗體可特異性地識別能夠表達fam19a5(his標記)的hek293t細胞(圖4b)。
<實施例5>通過免疫組織化學的發育過程測量fam19a5蛋白質表達這里使用免疫組織化學法，以確認翻譯后的fam19a5蛋白質表達模式是否類似。用與上述方法相同的方式管理小鼠。處死出生前胚胎期為第12天(e12)～第18天(e18)的小鼠而從其顱骨中取得腦。在含有4％多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液中固定(后固定)24～48小時，然后用含有30％蔗糖的磷酸鹽緩沖液處理24小時。然后，將所述腦置于用于腦組織的模具中，其中加入含有30％糖溶液的oct復合物并在干冰上進行冷凍，使用前在-80℃下進行保存。
為了通過免疫組織化學確認小鼠腦中的fam19a5蛋白質表達的區域和強度，使用了實施例4中所制備的多克隆抗體作為可與所述fam19a5蛋白質反應的抗體，即anti-fam19a5。使用恒冷超薄切片機將小鼠的冷凍腦組織切片成40μm厚度。用pbs溶液清洗腦組織切片30分鐘，然后用含有10％血清氯化物的pbs-t溶液(在磷酸鹽緩沖液中含有10％tritonx-100的溶液)進行封閉一個小時。如最終的熒光圖像所示，為了避免鄰近的非特異性抗原-抗體反應并準確區分fam19a5特異性表達區域，將fam19a5抗體與封閉溶液之比設成1：500。fam19a5抗體與抗原在4℃下過夜反應或在常溫(25℃)下反應約3小時。待一抗-抗原反應結束后，用磷酸鹽緩沖液清洗所述腦組織切片3次，每次10分鐘。然后，以1:500比例稀釋作為二抗的與fitc結合的兔抗igg(invitrogen,usa)后進行使用。待完成二抗-抗原反應后，用磷酸鹽緩沖液清洗所述腦組織切片3次，每次10分鐘，而后將所述組織平整地放置在載玻片上。在常溫下干燥所述組織5分鐘，將crystal/mount溶液(biomedacorp.,usa)涂在所述組織上，而后用蓋玻片蓋住來制備標本。通過利用共聚焦顯微鏡(zeisslsm510confocalmicroscopy)來觀察所制備標本的熒光圖像。
神經干細胞或神經祖細胞具有稱為巢蛋白的中間絲蛋白，則將巢蛋白用作標記【lendahletal.,cell60:585-595,1990】。在早期發育階段，觀察到在神經管形成前，巢蛋白已在神經板中進行過表達【woodburyetal.,jneuroscires61:364-370,2000】。由于成神經細胞具有微管相關蛋白雙皮質素(dcx)，將dcx用作標記。巢蛋白和dcx使用了經1:500比例稀釋的、有結合cy3的抗小鼠和山羊igg(invitrogen,usa)作為二抗。
如圖5所示，有趣的是，如同使用原位雜交的實驗結果，即使在蛋白質水平上，fam19a5蛋白質在腦室區內的表達也強。胚胎期第12天(e12)為正處于分裂的祖細胞主要分布于腦室區的期間，在該期間內，fam19a5肽主要地在整個腦室區內進行表達，而且在胚胎期期第14天(e14)和第18天(e18)內仍進行高表達。在皮質板內的表達量與使用原位雜交的實驗結果相比更低。在包含巢蛋白的祖細胞中，fam19a5蛋白質展示出點狀形態。在包含dcx的成神經細胞成神經細胞中，展示出弱表達。在一些基因中，由于轉錄或翻譯后的制備步驟，蛋白質表達與mrna表達的水平可不相同【wellingtonetal.,labinvest82:273-283,2002】，然而在本發明中展示出相同的表達模式。
除了實施例3的結果外，實施例5的結果說明在發育過程中腦組織中的fam19a5蛋白質的鑒定、表達位點、表達水平或表達強度。認為，fam19a5會在組成中樞神經系統的神經干細胞內進行表達，而且會參與到神經元和膠質細胞的表達中。
<實施例6>通過免疫組織化學的成體神經干細胞測量fam19a5蛋白質表達與出生前小鼠類似，通過免疫組織化學確認在成年小鼠的腦中fam19a5蛋白質表達的區域和強度。
因此，向以上述方法管理的4周齡雄性小鼠腹腔注射0.5cc/100g聚氨酯來進行麻醉，切割胸部，將ringer針插進左邊心室，用0.9％食鹽水(200ml)排血，然后用含有4％多聚甲醛的0.9％食鹽水(200ml)對所述心室進行灌流，并固定。提取所固定的小鼠腦，用含有4％多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液固定24～48小時，然后用含有30％糖的磷酸鹽緩沖液處理約24小時。然后，將所述腦置于用于腦組織的模具中，其中加入含有30％糖溶液的oct復合物，并在干冰上進行冷凍，使用前在-80℃下進行保存。與出生前小鼠類似，為了確認通過免疫組織化學的成年小鼠的腦中fam19a5蛋白質表達的區域和強度，使用fam19a5抗體。此外，由于成體神經干細胞(室管膜細胞和星形膠質細胞)具有叫作膠質纖維酸性蛋白(gfap,invitrogen,usa)的中間絲蛋白，將gfap用作標記。
如圖6a所述，與發育階段的實驗結果類似，在已知分布有成體神經干細胞群的腦室下區(svz)中，fam19a5的表達程度高。
因此，結論為，比起成神經細胞，在神經干細胞中的fam19a5表達更高。
由此可測定fam19a5的蛋白質量在分化條件下是否會下降。為此，針對svz-rmsob帶進行實驗。
腦室下區(svz)中的成神經細胞通過嘴側遷移流(rms)遷移至嗅球(ob)，然后最終分化成成熟的中間神經元。由于svz-rms中的fam19a5表達高于ob中的fam19a5表達，可認為蛋白質的量在分化過程中降低(圖6b)。
<實施例7>從成體神經干細胞中發育的神經球中對fam19a5表達的測量由于神經干細胞連續增殖技術的提高，因此可以形成從神經干細胞發育而成的稱為神經求的細胞團。在各種實驗中會用到此項技術，而且被當作是能反向追蹤神經干細胞特性的有用的實驗模型【reynoldsandweiss,science255:1707-1710,1992；reynoldsandweiss,devbiol275:1-13,1996】。
為了獲得成體神經干細胞，從3周～8周齡雄性小鼠中取出腦。可使用腦模具(brainmatrices)，以分離出已知具有成體神經干細胞群的腦室下區。通過使用如分散酶(invitrogen,usa)和木瓜蛋白酶(worthingtonbiochemicalcorp.,usa)的蛋白酶來使組織解離成單個細胞。在培養液中添加如表皮生長因子(egf,invitrogen)和堿性成纖維細胞生長因子(bfgf,invitrogen)的生長因子，從而有選擇地增殖細胞而形成神經球。除了成體神經干細胞，從胚胎期為12(e12)的出生前小鼠腦中分離出大腦皮層，并以相同方法有選擇地培養胚胎神經干細胞來獲得神經球。
通過使用層粘連蛋白(invitrogen,usa)為細胞粘附蛋白，將由成體神經干細胞組成的神經球和由胚胎神經干細胞組成的神經球固定在培養平板上，然后以免疫細胞化學法來測定fam19a5蛋白質是否表達。在含有4％多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液中固定所獲物15分鐘，然后用pbs-t溶液(在磷酸鹽緩沖液中包含0.5％tritonx-100的溶液)進行透化處理5分鐘。待封閉處理30分鐘后，進行抗原-抗體反應，然后使用dapi染色來觀察細胞核。
fam19a5蛋白質在大多數的神經球中表達。由于所述蛋白質為分泌性蛋白質，在細胞質中所述蛋白質被染成點狀形態(圖7)。
此外，為了知道表達fam19a5蛋白質的細胞的特性，用各種神經干細胞標記同時對神經球進行染色。
由此，表達fam19a5蛋白質的細胞可同時表達出巢蛋白(圖8a)。這表明，從神經干細胞中獲得的神經球可用作研究fam19a5的良好實驗模型。
此外，為了驗證神經球中的fam19a5基因表達是否強過相同家族的其他類型的基因表達，從成體神經干細胞中發育的神經球中提取所有的rna。然后，通過使用逆轉錄酶和隨機六聚體來制備cdna。通過利用相應的引物進行pcr，并觀察神經球中fam19a5mrna的分布。將pcr中所用的引物的信息列在表1中。
如圖8b所示，fam19a家族基因中的fam19a5mrna較其他類型分布得顯著更多。
除了rt-pcr,，利用微陣列對比fam19a家族基因的表達程度。根據affymetrix,inc.(www.affymetrix.com)提供的基礎實驗方案進行制備cdna和標記crna及與affymetrixmoe430v2.0genechip(46kprobe-sets)的雜交反應。為了便于分析，在cdna合成中使用了熒光標記，而且為了對表達量進行統計學分析，使用了chipinspector軟件(genomatixsoftwaregmbh)。
如圖8c所示，與rt-pcr中的結果類似，fam19a5基因的表達量較其他類型基因的表達量顯著更高。此外，正態化之后的水平為4～14。考慮到水平10或以上的基因分布甚少，該結果表明fam19a5為一種在神經球內具有強表達的基因。
實施例6和實施例7的結果強烈暗示，fam19a5可以是在成體神經干細胞和胚胎神經干細胞的功能中或所述細胞向其他類型細胞分化的過程中起重要作用的物質。
<實施例8>抗體針對fam19a5的中和作用后根據分析神經元和膠質細胞的特異性標記的所生成的星形膠質細胞的數值變化為了確認從神經干細胞形成并分泌的fam19a5蛋白質是否會影響從其中分化出的細胞的形成，使用了fam19a5特異性抗體。
為了進行分化測試，通過利用accutase(innovativecelltechnologiesinc.,usa)將神經球解離成單個細胞。在24孔板中每孔加入50,000個細胞并在含有生長因子的培養液中放置一天以使之穩定。第二天，將所述溶液更換成含有能夠促進分化的因子的分化培養溶液。誘導分化6天，同時每天添加fam19a5抗體(500ng/ml)來進行處理。通過使用三種類型的神經系統細胞(神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞)的標記，來進行免疫印跡法(westernblotting)和免疫細胞化學法。
如圖9所示，有趣的是，在使用相應的能夠誘導fam19a5蛋白質的中和作用的抗體的實驗組中，tuj1標記的神經元的數量較用正常rbigg處理的對照組提高了約兩倍，而標有gfap的星形膠質細胞的數量相應減少。
由此可認為，在從干細胞到其他類型細胞的分化過程中fam19a5蛋白質可作為功能性分子，尤其是，可參與促進星形膠質細胞的形成。
<實施例9>fam19a5肽和特異性抗體對神經干細胞增殖的影響
為了確認從神經干細胞形成并分泌的fam19a5蛋白質是否影響增殖，使用了fam19a5的肽和特異性抗體。為了進行增殖實驗，將神經球解離成單個細胞。在24孔板中每孔加入50,000個細胞，并用肽或抗體來處理含有生長因子的培養液。用所述生長因子誘導增殖6天，同時每天以500ng/ml的fam19a5肽和特異性抗體來進行處理。在最后一天，將形成的神經球解離成單個細胞，并測量細胞數。
如圖10所示，可發現，由于fam19a5肽的存在，神經干細胞的增殖較對照組明顯下降，而且當添加所述特異性抗體來進行處理時，增殖有增加。
<實施例10>創傷性腦損傷(tbi)小鼠模型中fam19a5蛋白質的量變為了確認在腦損傷后fam19a5蛋白質的量是否變化，這里使用了創傷性腦損傷模型。固定8周齡小鼠的頭部，然后將經液氮充分冷卻的鐵棒置于顱骨右側一分鐘。通過手術將小鼠的皮膚縫合，然后以與正常小鼠相同的方式管理所述小鼠7天【moonetal.,neuroreport22:304-308】。
待7天后，腹腔麻醉所述小鼠，切開胸部，將ringer氏針插進左邊心室，用0.9％食鹽水(200ml)排血，然后用含有4％多聚甲醛的0.9％食鹽水(200ml)對所述心室進行灌流，并固定該心室。提取被固定小鼠的腦，用含有4％多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液固定24～48小時，然后用含有30％糖的磷酸鹽緩沖液處理約24小時。然后，將所述腦置于用于腦組織的模具上，在干冰上以含有30％糖溶液的oct復合物進行冷凍，在-80℃下進行保存直至使用。使用恒冷超薄切片機，將小鼠的冷凍腦組織切成40μm厚度切片，然后進行免疫組織化學分析。
當受到外部傷害時，成熟星形膠質細胞通過逆分化過程成為放射狀膠質細胞。這些種類的細胞能夠表達出被叫作巢蛋白的祖細胞標記，而且在其位點上能夠形成膠質細胞。
如圖11a所示，可觀察到在受損區域(半暗帶)內表達fam19a5的細胞數量有明顯上升。所述受損區域內的放射狀膠質細胞能夠表達作為標記的巢蛋白，而且同時能夠表達fam19a5，而且蛋白質的量較未受損的對照組有明顯增加。
此外，雖比例非常低，從腦室下區通過胼胝體(cc)遷移至腦部受損區域的成神經細胞沒有表達fam19a5肽。除了所述受損區域外，在神經干細胞群所在的腦室下區的周邊地區中，表達fam19a5蛋白質的細胞數量有增加，而且這些還同時表達作為星形膠質細胞標記的gfap。由此認為，與神經元的形成相比，從神經干細胞中形成的fam19a5肽會更有可能參與到星形膠質細胞的形成當中。
同時，當腦部受傷后血腦屏障受損時，作為分泌性因子的fam19a5有可能會滲進血液中。此時，通過測定有無表達或表達程度，可研發出能夠測定腦部受損疾病或腦部疾病的發病、進展和緩解的診斷標記。為了知道其可能性，從正常小鼠和腦部受傷7天后被認為fam19a5表達最高的小鼠中獲取血液并使之凝結。然后，僅分離血清并進行放射免疫分析。
利用標準曲線測量血清中蛋白質量。結果，令人驚訝的是，在腦部受損7天后小鼠的血清內檢測到的fam19a5蛋白質是正常細胞的7倍或以上(圖11b)。
<實施例11>創傷性腦損傷(tbi)后fam19a5蛋白質隨時間的量變
僅在能夠表達gfap的反應性星形膠質細胞中，觀察到創傷性腦損傷(tbi)后fam19a5蛋白質隨時間的量變。
如圖12所示，經測定，受傷3天后，用gfap標記的星形膠質細胞中的fam19a5表達較弱，5天后表達開始增長，而且持續增長了7天。
<實施例12>測量肌萎縮側索硬化癥(als)中展示出的fam19a5蛋白質的數量增長在als模型動物msod1g93atg小鼠中，對處于表現als癥狀的期間的組織進行免疫組化分析。如圖13a所示，結果展示了，與同齡小鼠相比，在msod1g93a小鼠的脊髓中，fam19a5表達增長至很高水平。在腹角中強烈觀察到這種表達增長，而在腹角中由于als的分布而尤為使運動神經元退化死亡。在此期間，在msod1g93a小鼠的脊髓中可觀察到膠質細胞的增殖。這種病理改性過程通過gfap雙染也可發現。底部的放大照片為msod1g93a小鼠的腹角的高倍率圖像。
可以知道，大多數用gfap標記的膠質細胞展示出高水平的fam19a5表達。同時，認為分布在照片中央的細胞(箭頭指示)是退行性運動神經元，因為這些細胞具有圓形細胞核且未被gfap染色。甚至此時，還能觀察到較強的fam19a5表達。通過hoechst染色，用藍色熒光對細胞核進行反標(counter-label)。
此外，通過免疫印跡法觀察表達的變化。結果顯示，與野生型(wt)小鼠相比，als模型小鼠(tg)脊髓中的fam19a5表達增長至很高水平(圖13b)。
以與實施例10相同的方式進行放射免疫分析。結果顯示，als模型小鼠的血清中的fam19a5蛋白質的量是普通小鼠的3倍或以上(圖13c)。
在包括創傷性腦損傷的腦損傷模型和包括肌萎縮側索硬化癥的脊髓損傷疾病模型中檢測到fam19a5，因此可以研發fam19a5成為中樞神經系統損傷的標記物質。
<實施例13>創傷性腦損傷(tbi)后經fam19a5抗體處理的反應性星形細胞增生的延遲效果為了確認在誘導腦損傷后表達增加的fam19a5蛋白質的功能，誘導損傷的第二天向小鼠尾部的靜脈中注射fam19a5抗體。可認為，當發生創傷性腦損傷時，會破壞受損區域周邊的血腦屏障，從而抗體可能進入周圍腦組織。
只有當注射fam19a5抗體，才能觀察到由二抗引起的熒光信號(圖14)。
受傷后第二天注射抗體。從誘導損傷的那天起經過3、5和7天后，通過利用各種細胞標記來觀察各種變化。
如圖15所示，經過3天后，與注射了正常兔igg的對照組相比，在注射了fam19a5抗體的小鼠模型中，受損組織附近表達gfap的反應性星形膠質細胞的形成受到了抑制。這種現象在經過5天之后更加明顯，甚至經過7天后還能微弱維持。因此，可認為，通過抗體抑制分泌fam19a5會影響周圍細胞，尤其是延遲受損后出現的反應性星形細胞增生。
同時，受損后形成的反應性星形膠質細胞會分泌能夠防止細胞程序性死亡的生長因子，如gdnf，同時起到吸收谷氨酸的作用，因此，對減少神經元周圍的有毒環境起到積極作用。因此，進行tunel染色根據fam19a5抗體來測定反應性星形細胞增生的延遲是否會對保護神經元的功能產生負面影響。
如圖16所示，經測定，表達作為神經元標記的neun的細胞沒有同時被tunel染色，從反應性星形膠質細胞的損失沒有殺死神經元。
根據實施例10，創傷性腦損傷后從受損區域形成的反應性星形膠質細胞強烈地表達fam19a5蛋白質。基于該結果，在創傷性腦損傷后經fam19a5抗體處理的小鼠模型中，測定了表達fam19a5蛋白質的反應性星形膠質細胞的位置。
如預測的那樣，可觀察到，在注射了fam19a5抗體的受損模型中，表達fam19a5蛋白質的星形膠質細胞所處的位置較對照組與所述受損區域相對分離。
<實施例14>創傷性腦損傷(tbi)后由fam19a5抗體處理所知的少突膠質祖細胞的數值下降。
通過利用上述相同的實驗方法，用各種類型的膠質細胞標記進行染色，以確認fam19a5抗體是否影響各種類型的膠質細胞的形成。
腦損傷后經過5天時，在受損區域中表達神經元-膠質細胞抗原2(ng2)的少突膠質祖細胞的數量下降(圖18a)。
同時，由于已知在受損腦組織中分裂的ng2細胞可成為能夠形成成熟髓鞘的少突膠質細胞，用髓鞘堿性蛋白(mbp)標記的成熟少突膠質細胞進行觀察，發現其數量也有下降(圖18b)。
因此，腦損傷后出現的fam19a5的活化能夠促進ng2祖細胞的增殖，而且認為可其參與周圍神經元軸突的髓鞘化。
工業應用性
本發明的fam19a5或其抑制劑可用作干細胞增殖或分化的調節劑、以及用于中樞神經系統損傷、退行性腦部疾病或中樞神經系統疾病的診斷試劑盒、芯片或將治療劑。