所屬技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于腫瘤細(xì)胞免疫治療技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及雙氧化酶duox2的新用途，具體涉及雙氧化酶duox2修飾的dc細(xì)胞在靶向殺傷胰腺癌起始細(xì)胞中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

胰腺癌是致死率最高的惡性腫瘤之一，全球每年的新發(fā)病例和死亡人數(shù)接近25萬(shahm，dasilvar，gravekampc，libuttisk，abrahamt，dadachovae.targetedradionuclidetherapiesforpancreaticcancer.cancergenetherapy.2015；22(8)：375-9)。由于發(fā)展早期沒有顯著的癥狀，胰腺癌通常只能在晚期被診斷，臨床研究報(bào)道胰腺癌對(duì)放化療不敏感并易產(chǎn)生耐受(bardeesyn，depinhora.pancreaticcancerbiologyandgenetics.naturereviewscancer.2002；2(12)：897-909)。目前，胰腺癌的主要治療方式是手術(shù)切除，通過完整的清除腫瘤組織，達(dá)到有效治療目的。近年來，盡管胰腺癌的手術(shù)切除和藥物治療不斷取得進(jìn)步，但是胰腺癌患者的死亡率居高不下，在最優(yōu)的輔助系統(tǒng)結(jié)合治療下胰腺癌患者五年生存期仍然不超過20％(bednarf，simeonedm.pancreaticcancerstemcellbiologyanditstherapeuticimplications.journalofgastroenterology.2011；46(12)：1345-52)。因此，新型胰腺癌治療手段的研發(fā)迫在眉睫。

腫瘤起始細(xì)胞是具備普通起始細(xì)胞分化特性的腫瘤細(xì)胞，并能通過自我更新和分化潛能形成腫瘤。腫瘤起始細(xì)胞是腫瘤組織獨(dú)特的細(xì)胞群，與腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤起始細(xì)胞對(duì)常規(guī)的放化療不敏感，易產(chǎn)生耐受，因此傳統(tǒng)的放化療不能有效殺傷腫瘤起始細(xì)胞，繼而使腫瘤起始細(xì)胞獲得增殖優(yōu)勢(shì)，最終引起腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移(fesslere，dijkgraaffe，desousaemf，medemajp.cancerstemcelldynamicsintumorprogressionandmetastasis：isthemicroenvironmenttoblame？cancerletters.2013；341(1)：97-104)。研究表明特異性靶向腫瘤起始細(xì)胞的細(xì)胞免疫治療能有效控制腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，顯著提升腫瘤患者的生存質(zhì)量與生命周期(iovinof，meraviglias，spinam，orlandov，saladinov，dielif，etal.immunotherapytargetingcoloncancerstemcells.immunotherapy.2011；3(1)：97-106；kwiatkowska-borowczykep，gabka-buszeka，jankowskij，mackiewicza.immunotargetingofcancerstemcells.contemporaryoncology.2015；19(1a)：a52-9)。晚期胰腺癌極易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)的抗腫瘤治療并未顯著降低胰腺癌患者的死亡率(bednarf，simeonedm.pancreaticcancerstemcellbiologyanditstherapeuticimplications.journalofgastroenterology.2011；46(12)：1345-52)，因此研發(fā)一種新型靶向殺傷胰腺癌起始細(xì)胞的免疫治療方法，對(duì)治療胰腺癌具有重要的研究意義。

目前，細(xì)胞免疫治療逐漸成為繼手術(shù)切除、放療和化療外的第四種腫瘤治療方法，以dc細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗是細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。dc細(xì)胞是體內(nèi)遞呈抗原能力最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞(apc)，具有連接機(jī)體天然免疫與適應(yīng)性免疫的作用。dc細(xì)胞通過識(shí)別、處理和遞呈抗原給t淋巴細(xì)胞，從而啟動(dòng)抗原特異性cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞反應(yīng)。此外，耐受原的dc細(xì)胞誘導(dǎo)t細(xì)胞失能，促進(jìn)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致免疫耐受(gehriee，vandertouww，brombergjs，ochandojc.plasmacytoiddendriticcellsintolerance.methodsinmolecularbiology.2011；677：127-47)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)激活耐受原dc細(xì)胞，介導(dǎo)treg的產(chǎn)生來實(shí)現(xiàn)免疫逃逸(pinzon-charrya，maxwellt，lopezja.dendriticcelldysfunctionincancer：amechanismforimmunosuppression.immunologyandcellbiology.2005；83(5)：451-61；gajewskitf，schreiberh，fuyx.innateandadaptiveimmunecellsinthetumormicroenvironment.natureimmunology.2013；14(10)：1014-22)。jun-o等發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞通過抑制轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白abcg2的表達(dá)誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受原的dc細(xì)胞，繼而產(chǎn)生免疫耐受(jinjo，zhangw，wongkw，kwakm，vandrielir，yuq.inhibitionofbreastcancerresistanceprotein(abcg2)inhumanmyeloiddendriticcellsinducespotenttolerogenicfunctionsduringlpsstimulation.plosone.2014；9(8)：e104753)。研究表明，負(fù)載腫瘤相關(guān)抗原的dc疫苗能有效規(guī)避免疫系統(tǒng)的耐受性，引發(fā)強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

雙氧化酶duox2首先發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物的甲狀腺，duox2有兩個(gè)亞型：hduox1和hduox2，其中hduox1主要分布于呼吸道上皮細(xì)胞，hduox2主要表達(dá)于唾液腺和胃腸道。目前，duox2被認(rèn)為參與調(diào)控真核生物非吞噬細(xì)胞過程中活性氧(ros)的生成，遺傳分析表明duox2調(diào)控的ros在高血壓、腫瘤和囊胞性纖維癥等疾病過程中起到非常的重要的作用(radab，lekstromk，damians，dupuyc，letotl.thepseudomonastoxinpyocyanininhibitsthedualoxidase-basedantimicrobialsystemasitimposesoxidativestressonairwayepithelialcells.journalofimmunology.2008；181(7)：4883-93；nguyendm，parekhpr，changet，sharmank，carrierf.contributionofdualoxidase2(duox2)tohyper-radiosensitivityinhumangastriccancercells.radiationresearch.2015；184(2)：151-60)。duox2在腫瘤生物學(xué)方面的研究主要集中在duox2表達(dá)紊亂誘導(dǎo)ros的產(chǎn)生、堆積對(duì)炎癥相關(guān)腫瘤的生成，腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和腫瘤耐藥方面的作用和影響(wuy，antonys，hewittsm，jiangg，yangsx，meitzlerjl，etal.functionalactivityandtumor-specificexpressionofdualoxidase2inpancreaticcancercellsandhumanmalignanciescharacterizedwithanovelmonoclonalantibody.internationaljournalofoncology.2013；42(4)：1229-38)。此外，有報(bào)道指出duox2過表達(dá)協(xié)同天然免疫促進(jìn)腫瘤的生成(wuy，luj，antonys，juhasza，liuh，jiangg，etal.activationoftlr4isrequiredforthe synergisticinductionofdualoxidase2anddualoxidasea2byifn-gammaandlipopolysaccharideinhumanpancreaticcancercelllines.journalofimmunology.2013；190(4)：1859-72)。目前尚無duox2在胰腺癌起始細(xì)胞的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種新型胰腺癌細(xì)胞免疫治療的設(shè)計(jì)方法，首次提出duox2作為胰腺癌起始細(xì)胞相關(guān)抗原，本發(fā)明還提供了duox2修飾的dc疫苗的制備方法。該方法用duox2修飾樹突狀細(xì)胞，靶向殺傷胰腺癌起始細(xì)胞，抑制胰腺癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，解決了傳統(tǒng)手術(shù)切除以及放化療無法有效殺死胰腺癌起始細(xì)胞，而沒能達(dá)到理想的治療效果，以及僅含有胰腺癌相關(guān)抗原的dc疫苗，未能產(chǎn)生長(zhǎng)期的治療效果等科學(xué)技術(shù)問題。

本發(fā)明的目的是按以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明采用基因芯片技術(shù)，對(duì)cd44⁺cd24⁺esa⁺胰腺癌起始細(xì)胞與cd44^-cd24^-esa^-非胰腺癌起始細(xì)胞以及胰腺癌和正常胰腺進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，篩選出cd44⁺cd24⁺esa⁺的胰腺癌起始細(xì)胞以及胰腺癌高表達(dá)的基因duox2，然后通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證duox2作為抗原可誘導(dǎo)靶向殺傷肝癌起始細(xì)胞的能力。采用電穿孔的方法將duox2質(zhì)粒導(dǎo)入dc細(xì)胞，在體外實(shí)驗(yàn)中激活抗原特異性t細(xì)胞，靶向殺傷胰腺癌起始細(xì)胞，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體內(nèi)能引發(fā)較強(qiáng)的抗原特異性t細(xì)胞免疫反應(yīng)，抑制胰腺癌的成瘤能力。這些研究結(jié)果為靶向殺傷胰腺癌起始細(xì)胞的新型免疫治療方法提供了依據(jù)，同時(shí)為靶向殺傷胰腺癌起始細(xì)胞的免疫治療在臨床上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果表明duox2在cd44⁺cd24⁺esa⁺胰腺癌起始細(xì)胞和胰腺癌組織中高表達(dá)；

圖2是本發(fā)明基因修飾的dc和未經(jīng)修飾的dc免疫表型流式細(xì)胞鑒定的結(jié)果；

圖3是本發(fā)明基因修飾的dc和未經(jīng)修飾的dc疫苗免疫原性的ics結(jié)果；

圖4是duox2抗原特異性ctl細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞panc1的體外殺傷結(jié)果；

圖5是panc1細(xì)胞與基因修飾dc刺激的ctl和未修飾dc刺激的ctl分別接種裸鼠，檢測(cè)5周內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)體積和腫瘤細(xì)胞cd44⁺cd24⁺esa⁺的胰腺癌起始細(xì)胞的比例。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。

實(shí)施例1：胰腺癌起始細(xì)胞和胰腺癌相關(guān)抗原的基因篩選與鑒定

采用基因芯片篩選在cd44⁺cd24⁺esa⁺胰腺癌起始細(xì)胞與cd44^-cd24^-esa^-非胰腺癌起始細(xì)胞以及胰腺癌和正常胰腺組織中差異表達(dá)的基因譜。首先用流式細(xì)胞儀分選出胰腺癌起始細(xì)胞和非胰腺癌起始細(xì)胞，分別提取胰腺癌起始細(xì)胞和非胰腺癌起始細(xì)胞以及胰腺癌和正常胰腺組織的總rna，通過affymetrixhumangene1.0st人類基因表達(dá)譜芯片掃描分析，初步篩選出cd44⁺cd24⁺esa⁺胰腺癌起始細(xì)胞和胰腺癌中高表達(dá)的基因duox2，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證了所篩選出的duox2基因在胰腺癌起始細(xì)胞和胰腺癌中高表達(dá)。

實(shí)施例2：duox2修飾的dc疫苗制備

1、外周血單核細(xì)胞分離：

取出血液，緩慢加到ficoll分離液上層，1000g離心30min，吸取分界處白色pbmc，1640培養(yǎng)基重懸；350g離心8min，去除上清，重復(fù)三遍，加10ml培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，培養(yǎng)dc。

2、dc的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

調(diào)整細(xì)胞濃度為3×10⁶/ml，取6ml加到t25培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％co2孵箱中培養(yǎng)2h后取出，棄去懸浮的細(xì)胞，輕輕沖洗，加入6ml含gm-csf(50ng/ml)、il-4(50ng/ml)、雙抗(100u/ml)和10％fbs的rpmi-1640培養(yǎng)基，5天后加3ml含il-1β(10ng/ml)，il-6(100ng/ml)、tnf-α(10ng/ml)、pge2(1μg/ml)、cd40lwithenhancer(1μg/ml)、ifn-α(3000μ/ml)、il-4(800u/ml)、gm-csf(50ng/ml)、il-4(50ng/ml)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。350g、8min離心，去除上清，通過amaxadc電轉(zhuǎn)染儀將duox2質(zhì)粒或?qū)φ召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染至成熟的dc細(xì)胞中，用10％的人血白蛋白的dc培養(yǎng)液培養(yǎng)，24h內(nèi)使用。

實(shí)施例3：duox2修飾的dc疫苗誘導(dǎo)特異性t細(xì)胞反應(yīng)

1、抗原特異性的t細(xì)胞制備與免疫原性檢測(cè)

將負(fù)載duox2抗原的成熟dc細(xì)胞及t細(xì)胞按1∶10的比例混勻，加到含終濃度為5ng/mlil-7，20iu/mlil-2的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，每天換液，第7天得到負(fù)載duox2抗原的dc細(xì)胞刺激的t細(xì)胞。

2、成熟dc細(xì)胞的免疫表型檢測(cè)

取成熟的dc細(xì)胞，用pbs洗2次后，各取1×10⁵/ml，分別加入相應(yīng)的流式管中。加入待檢測(cè)單克隆抗體包括hla-dr、cd80、cd83和cd86抗體各1μl，4℃避光孵育30分鐘。用pbs洗2次，用400μl的pbs重懸，采用流式細(xì)胞儀cytoflex(beckman)檢測(cè)。

3、成熟dc疫苗免疫原性檢測(cè)

分別用dmso、duox2抗原肽(1ug/ml)和pma(40ng/ml)+ionomycin(1000ng/ml) percp抗體孵育30min后，用cytofix/cytoperm破膜液孵育30分鐘，加入ifn-r--pe、il-2--apc-cy7、tnf-a--pe-cy7抗體孵育60分鐘，上機(jī)檢測(cè)。

實(shí)施例4：duox2抗原特異性細(xì)胞毒t淋巴細(xì)胞(ctl細(xì)胞)對(duì)胰腺癌起始細(xì)胞特異性的殺傷

1、體外殺傷實(shí)驗(yàn)

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)制備好的duox2抗原特異性ctl細(xì)胞的殺傷能力。將1×10⁵panc1細(xì)胞(靶細(xì)胞)經(jīng)pbs洗滌后用200nmcfse染色，種于96孔板中，然后，ctl細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)按照1∶1、2∶1、5∶1、10∶1的效靶比加于孔內(nèi)。另設(shè)一孔不加效應(yīng)細(xì)胞的靶細(xì)胞孔，用于檢測(cè)靶細(xì)胞的自發(fā)凋亡。效靶細(xì)胞共同孵育5h洗滌后，加入10μg/ml的pi孵育20min，最后在流式細(xì)胞儀cytoflex(beckman)中檢測(cè)殺傷效果及cd44⁺cd24⁺esa⁺細(xì)胞的比例。

結(jié)果表明負(fù)載duox2抗原的dc細(xì)胞誘導(dǎo)的ctl細(xì)胞對(duì)d44⁺cd24⁺esa⁺胰腺癌起始細(xì)胞的殺傷能力最強(qiáng)。參見圖所示，panc1細(xì)胞與負(fù)載duox2抗原的dc細(xì)胞誘導(dǎo)的ctl細(xì)胞混合培養(yǎng)5h后，panc1細(xì)胞中d44⁺cd24⁺esa⁺細(xì)胞比例與對(duì)照組相比降低，說明負(fù)載duox2抗原的dc細(xì)胞誘導(dǎo)的ctl細(xì)胞能特異性的殺傷胰腺癌起始細(xì)胞。

2、體內(nèi)殺傷實(shí)驗(yàn)

2×10⁶panc1細(xì)胞與2×10⁷基因修飾dc刺激的ctl細(xì)胞混合后，種植于裸鼠皮下，對(duì)照組注射panc1和未修飾dc刺激的ctl混合細(xì)胞。每周測(cè)量腫瘤體積大小，35天后處死所有裸鼠，取出胰腺癌組織，制備成單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀cytoflex(beckman)檢測(cè)腫瘤內(nèi)cd44⁺cd24⁺esa⁺細(xì)胞的比例。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)負(fù)載duox2抗原的dc細(xì)胞誘導(dǎo)的ctl細(xì)胞混合注射組中，其腫瘤細(xì)胞中cd44⁺cd24⁺esa⁺細(xì)胞比例明顯降低，腫瘤體積顯著降低。這些結(jié)果表明負(fù)載duox2抗原的dc細(xì)胞誘導(dǎo)的ctl細(xì)胞能特異性殺傷胰腺癌起始細(xì)胞，從而有效抑制了胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)也說明腫瘤起始細(xì)胞在腫瘤生長(zhǎng)過程中發(fā)揮重要的作用。