本發明涉及生物制藥領域，具體而言，本發明涉及一種止血材料及其制備方法。

背景技術：

臨床實踐的統計結果顯示受傷或術后無法控制的出血是造成死亡的主要原因，在醫療現場止血手段是非常重要的，在止血以及完全止血之前，縮短止血時間與減少失血量都非常重要。如果不能完全止血，手術中出血則會影響視野，使手術的難度增加，手術后出血則容易感染，導致手術后護理困難，甚至出現再次手術的情況。近年來醫用可吸收止血材料引起了各國醫學界和產業界的高度重視，許多大型醫藥公司都力圖研制開發出自己的新型止血材料，如奧地利林茨市hafslundnycomed醫藥公司研制開發的taehocomd可吸收創面止血封固劑、gelfix止血材料以及surgieel再生纖維素止血材料等，目前常用的可吸收止血材料有纖維蛋白膠、明膠海綿、氧化纖維素、微纖維膠原、殼聚糖及藻酸鈣纖維等，它們的作用機理和使用方法不盡相同，止血效果也有差別?，F有技術中常用的止血方法包括(1)用機械手段的止血方法，(2)加速局部血凝固的止血方法。在使用機械方法例如綁扎或縫合不能有效止血的情況下，通常需要使用止血材料用于局部止血。而可吸收止血材料在各種外科手術中，可以直接減少機體失血從而有效維持血容量，避免全身凝血藥物使用所帶來的不良反應，從而減少輸血及手術時間；減少術后滲出、降低并發癥，因此可吸收止血材料的應用與研發就受到各國醫學界和產業界的高度重視。目前國內外已上市的可吸收止血材料有纖維蛋白膠、明膠海綿、氧化纖維素、改性淀粉、殼聚糖及藻酸鈣纖維等。

可溶性止血紗布，在國外又稱速即紗surgicel，是一種再生氧化纖維編織紗塊，屬于羧甲基纖維素類止血材料。surgicel貼敷后10s即于接觸處快速溶解，1-3min創面滲血逐漸減少至停止變為膠體，此時黏附力變強，但與活動性出血創面的黏附力較差，止血時間的長短與創面滲血量、出血量及創面部位、個體差異有關。伍尚敏研究結果顯示使用surgicel術后觀察傷口及創面無再出血、滲血、感染、液化及異物反應，周圍無紅腫硬結和皮疹。留置引流的傷口，引流液無特殊。取皮區于兩周打開，發現貼敷surgicel處較傳統凡士林油紗覆蓋處，表皮愈合光整。對手術傷口的愈合無明顯影響，均未發現過敏、感染等不良反應。

mnagamatsu等在神經系統疾病的形成研究中發現，不但會影響傷口愈合，而且會通過一種彌漫性化學機理引起神經損傷。這一實驗結果提示氧化纖維素的酸性可能引起神經纖維變性，應避免對外圍神經直接使用大量氧化纖維素。

steveer等對氧化纖維素材料進行改良研制了一種鈣改性的氧化纖維素止血劑，該產品不但生物吸收性良好而且止血作用優于氧化纖維素。氧化纖維素和氧化再生纖維素的吸收時間隨用量和吸收的血量多少，以及局部組織的性質而定，一般為3-6周。亦有報道氧化再生纖維素在骨腔及顱內由于吸收血液使體積膨脹而產生壓迫神經癥狀。氧化纖維素有很強的吸水性，潮濕因素有損其止血作用，使用時應保持手套、器械干燥光滑。

殼聚糖(chitosans)具有止血、促進血管內皮生長、使肌原纖維代替膠原纖維的作用，在體內可被完全吸收。殼聚糖是來源于海洋的天然高分子化合物，是天然的動物性食物纖維。動物實驗證明其無任何急性和長期毒性，安全性相當于砂糖(ld為16g/kg)。殼聚糖是甲殼質脫乙?；某跫壯苌?，是一種多聚糖物質，化學名稱為b(1-4)-2-氨基-2-脫氧-d-葡聚糖。殼聚糖的基本單位是葡萄糖胺，而葡萄糖胺是人體內存在的物質，因此，殼聚糖與人體細胞有良好的親和性，無排斥反應，生物相容性好，可以生物降解，并有止血作用。殼聚糖的止血性在于殼聚糖帶有一定量的電荷，它的分子可以直接將創面上的紅細胞連接在一起，促使血液凝固，從而達到止血效果。此外，還有抑制多種細菌和真菌生長的作用，由殼聚糖做成的創面敷料還具有吸水透氧性，使得敷料下的創面組織可以得到足夠的氧分壓，有利于上皮細胞從周圍爬行，抑制成纖維細胞的生長的功能，所有這些特點都賦予它作為創面止血材料的良好性能。但是，由于殼聚糖本身止血作用有限，對于廣泛出血創面的止血效果不很理想，常采用復合其他止血劑方法如凝血因子、氯化鈣等。趙宏霞等利用膠原蛋白和殼聚糖制備了復合膜，大大降低了止血海綿的成本；且該復合膜止血作用良好，也是一種較好的止血材料。

腦、腎臟、肝臟、脾臟等實質性臟器創面出血的治療是外科領域面臨的難題，國內外許多大型制藥公司都力圖研發出止血迅速，并且不影響臟器功能的可吸收性止血材料。目前常用的可吸收止血材料有纖維蛋白膠、明膠海綿、氧化纖維素、微纖維膠原、殼聚糖和微孔多聚糖等。其中來源于淀粉的saph是純化的植物淀粉經過特殊工藝制成的球狀微小顆粒，內有多個孔道，且孔徑基本均一，具有很強的吸水性，能迅速吸收血液中的水分，并將血液中體積大于孔道孔徑的有形成分(如血小板、紅細胞、血蛋白、凝血酶和纖維蛋白等)聚集在顆粒表面，形成一種凝膠狀混合物，達到即可止血的作用；同時通過使血液濃縮，加速內源性凝血過程，縮短凝血時間，形成局部凝血塊，最終形成纖維蛋白凝塊，而產生快速止血作用。

白芨多糖是一種安全、有效的免疫反應調節劑、抗血管生成藥物以及傳統的單純tac治療。在治療潰瘍型結腸炎、手術中止血、急性上消化道大出血以及促進傷口皮膚愈合等方面，也有著廣闊的應用空間。作為一種天然高分子材料，白芨多糖是極有發展前途的生物敷料材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性。以明膠和白芨膠為支架材料把中藥提取物復合到其中，通過冷凍干燥法制備海綿狀多孔材料，空隙分布均勻，互相連通，用于培養小鼠成纖維細胞，能夠使細胞更好地黏附生長。白芨多糖能增強血小板第三因子活性，顯著縮短凝血時間及凝血酶原形成時間，抑制纖維蛋白溶酶活性，對局部出血有止血作用，對實質性器官(肝、脾)、肌肉血管出血等外用止血效果頗好。另外蘆薈可通過促進創面組織的膠原更新來影響創面的愈合；魔芋葡甘露聚糖又稱魔芋多糖，是一種以黏液狀葡聚糖粒子形式存在于魔芋球莖中的高分子水溶性多糖，含量高達55％以上，也有很好的止血作用。

中藥涼血止血藥物中的多糖成分也有很好的止血作用，比如：地榆多糖、蒲黃多糖、茜草多糖、仙鶴草多糖以及苧麻根多糖等。

上述的止血材料雖然能起到一定的止血作用，但在臨床應用上仍然存在一些問題。例如，纖維蛋白膠在臨床手術止血中應用較為廣泛，但纖維蛋白膠成分屬于血液制品，存在抗原性和病毒性疾病傳播的危險，其應用安全性受到一定的質疑，且成本較高；明膠海綿的創面組織附著力較差，容易破裂和脫落，對于較大的出血其止血效果欠佳；氧化纖維素較疏松，被機體吸收快，但可能導致再出血，且其產生的高酸性環境會通過一種彌漫性化學機理引起神經損傷；殼聚糖、羧甲基殼聚糖、海藻酸、改性淀粉等屬于天然多糖，在生產上存在批次穩定性差、質控困難等問題。因此，開發安全性更好，止血效果更佳的止血材料勢在必行。

技術實現要素：

本發明的目的之一在于提供一種止血材料。

本發明的另一目的在于提供所述止血材料的制備方法。

為解決上述技術問題，本發明采用了下述技術方案：

所提供的止血材料，即一種使用動物真皮制備的微纖維膠原止血材料，微纖維膠原產品和血液的混合物具有足夠的抗拉強度以抵抗纖維分離進而密封傷口，具有良好的止血性能，而且具有優良的生物相容性，在體內完全降解吸收，能應用于體內廣泛的部位；另外，生產上易于加工、滅菌及質量控制。

優選地，所述止血材料為微纖維膠原止血材料，其制備方法包括下述步驟：

(1)原料處理：使用硫化鈉4wt％-6wt％，乙醇濃度為40vol％脫毛。常規試驗脫毛時候，硫化鈉4wt％-12wt％的濃度，4wt％-6wt％濃度過低，脫毛過慢且效果不好，使用濃度過高則會對皮膚造成損傷，本發明中用于脫毛的硫化鈉濃度范圍為4wt％-6wt％，乙醇濃度為40vol％，可以在硫化鈉較低的濃度下達到很好的脫毛效果；

(2)切碎、纖維化：將上述處理過的原料用切割或研磨機將膠原制成粗纖維制品；

(3)溶脹控制：膠原進行機械粉碎或暴露在液體介質中時能為氫鍵提供更多的結合位點，這樣就導致了材料干燥時會角質化從而難以解聚成纖維或膨松化?？梢允褂糜袡C液體與水混溶作為水溶液，如低分子量醇、丙酮及類似物，如甲醇，乙醇，異丙醇，丁酮，丙酮等，有機液體與水比例從9：1至1：1，優選3：1的比例。其中，水的比例過高時，膠原纖維溶脹會為氫鍵提供過多的結合位點從而導致致密化。過度角質化和/或致密化會使得隨后的解聚與蓬松化難以達到所需的堆密度及表面積；

(4)干燥：采用抽真空氮氣保護加熱干燥或者冷凍真空干燥的方法制得膠原纖維束，避免干燥過程中膠原被氧化；

(5)解聚、蓬松：將得到的纖維束使用錘磨機進行處理得到微纖維膠原產品。微纖維化膠原及其衍生物具有足夠的止血及粘合性能；

(6)微纖維膠原材料通過co⁶⁰25kg劑量輻照滅菌，可應用于臨床。

優選地，加入去垢劑，可在上述步驟(1)-(3)中任一項所述的混合溶液中加入去垢劑，以達到有效去脂、去雜蛋白及降低免疫原性的目的。去垢劑的選擇，主要選用對蛋白質變性作用影響較小的中性去垢劑，即非離子表面活性劑，有聚乙二醇類：如peg200；多元醇類表面活性劑：如山梨醇、司盤類和吐溫類；優先使用吐溫80。

優選地，可在上述步驟(1)-(3)中任一項所述的混合溶液中加入酸，以達到低ph條件下的充分溶脹，使去脂去蛋白更有效；保證止血材料的粘合性能。與含酸的混合溶液處理的時間應延長，以使酸和膠原充分反應。纖維膠原分散過程中使用到的水溶液需含有一定量的酸，其中所述纖維化膠原分散摻入。酸含量約為與膠原結合所需酸的理論化學計量的50wt％-90wt％，優選60wt％。分散膠原與酸充分反應后進行漿化與洗滌(水-有機溶劑混合液)得到上述的膠原鹽。膠原鹽的制備，鹽酸是優選的酸，因其成本低廉并易于控制。其他無機或有機酸，諸如硫酸，氫溴酸，磷酸，氰基乙酸，乙酸，檸檬酸和乳酸均可。硫酸難于控制。檸檬酸與鹽酸類似。“易于控制的”指膠原纖維的溶脹和水解控制，以防止材料的快速降解為水溶性產物。

膠原產品的預期用途的適用性可通過體外“hat檢測”或“止血粘合檢測”。為使產品表現出所需的性質,最好使它含有至少5％的≤1mm有效長度的纖維以及含有不超過10％的＞12mm效長度的纖維。其中，短纖維(≤1mm)的比例低于下限值時，長纖維會發生聚集，止血及粘合性能均會有所損失。短纖維的比例過高時，粘合性能會有所損失。纖維長度分布和蓬松度由堆積密度不超過40kg/m³來保證。堆密度通過將纖維膠原未經任何壓縮步驟加入100毫升量筒中稱重測得。

本發明的微纖維膠原產品可由任何未變性天然膠原或脫灰膠原制備，如，生皮，腸，腱，軟骨或其他高纖維化膠原材料，切碎更易處理。膠原最好在濕/未經干燥處理過的狀態，如果經干燥處理，最好將變性降低到最小程度。滿意的原料為新鮮牛皮、小牛皮，鹽漬牛皮，濕鹿皮，豬皮，羊皮以及常規使用的用于制造皮革的山羊皮。首選原料是未經干燥的牛皮或從牛皮等動物皮制成的膠原。

更優選地，本發明提供了一種微纖維膠原止血材料，其通過下述方法制備，所述方法包括下述步驟：原料處理時加入乙醇，后續步驟使用去垢劑和酸。

優選地，所述制備方法包括下述步驟：

(1)原料處理：使用4wt％-6wt％硫化鈉，40vol％乙醇為動物皮脂脫毛；(2)切碎、纖維化：將上述處理過的原料用切割或研磨機將膠原制成粗纖維制品；(3)溶脹控制：將步驟(2)的粗纖維制品溶于有機溶劑與水的混合溶液；(4)干燥；(5)解聚、蓬松：將得到的纖維束使用錘磨機進行處理得到微纖維膠原產品；(6)滅菌：co⁶⁰25kg劑量輻照滅菌；

優選在步驟(1)～(3)任一步驟中加入去垢劑和/或酸。

優選地，步驟(3)中有機溶劑為低分子量醇、丙酮及類似物，優選甲醇，乙醇，異丙醇，丁酮，丙酮，有機溶劑與水的體積比為9：1至1：1，優選3：1；所述步驟(4)中的干燥優選真空氮氣保護加熱干燥或者冷凍真空干燥。

優選地，所述去垢劑選自非離子表面活性劑或多元醇類表面活性劑，優選peg200、山梨醇、司盤類和吐溫；所述酸選自無機酸或有機酸，優選鹽酸、硫酸、氫溴酸、磷酸、氰基乙酸、乙酸、檸檬酸或乳酸。

所述的微纖維膠原止血材料，可制成膜片、紗布，用于醫學手術止血和防粘連。

本發明還提供了所述微纖維膠原止血材料的制備方法，所述方法包括下述步驟：原料處理時加入乙醇，后續步驟使用去垢劑和酸。

優選地，所述制備方法包括下述步驟：

(1)原料處理：使用4wt％-6wt％硫化鈉，40vol％乙醇為動物皮脂脫毛；(2)切碎、纖維化：將上述處理過的原料用切割或研磨機將膠原制成粗纖維制品；(3)溶脹控制：將步驟(2)的粗纖維制品溶于有機溶劑與水的混合溶液；(4)干燥；(5)解聚、蓬松：將得到的纖維束使用錘磨機進行處理得到微纖維膠原產品；(6)滅菌：co⁶⁰25kg劑量輻照滅菌；

優選在步驟(1)～(3)任一步驟中加入去垢劑和/或酸。

優選地，步驟(3)中有機溶劑為低分子量醇、丙酮及類似物，優選甲醇，乙醇，異丙醇，丁酮，丙酮，有機溶劑與水的體積比為9：1至1：1，優選3：1；所述步驟(4)中的干燥優選真空氮氣保護加熱干燥或者冷凍真空干燥。

優選地，所述去垢劑選自非離子表面活性劑或多元醇類表面活性劑，優選peg200、山梨醇、司盤類和吐溫；所述酸選自無機酸或有機酸，優選鹽酸、硫酸、氫溴酸、磷酸、氰基乙酸、乙酸、檸檬酸或乳酸。

本發明所述微纖維膠原止血材料及其制備方法具有下述優點：

本發明在脫毛過程中使用添加乙醇的方式，降低了硫化鈉的使用濃度，提高了脫毛的效率。

(1)處理過程引入有機溶劑和非離子型去垢劑，有效去脂去雜蛋白，降低材料免疫原性，防止脫水過程氫鍵暴露產生的角質化，同時進行有效病毒滅活。

(2)本發明采用氮氣保護抽真空或者冷凍真空干燥的方式進行干燥，使膠原材料不被氧化變性，易保持微纖維膠原的活性，提高止血效果。

(3)處理過程中引入酸，生成膠原鹽酸鹽，以達到低ph條件下的充分溶脹，使去脂去蛋白更有效；保證止血材料的粘合性能。

(4)通過co⁶⁰25kg劑量輻照滅菌，可防止干熱滅菌帶來的材料氧化變性，保證材料止血性能。

(5)本發明所述微纖維膠原止血材料，具有足夠的止血及粘合性能。

(6)本發明制備的微纖維膠原止血材料創面組織附著力較好，不易被機體快速吸收，且具有優良的生物相容性，在體內完全降解吸收，能應用于體內廣泛的部位。

(7)本發明制備的微纖維膠原止血材料在生產上易于加工、滅菌及質量控制。

附圖說明

圖1表示使用不同止血材料后的止血時間；

圖2表示使用不同止血材料后出血量。

實施例

下面通過實施例對本發明作進一步說明。應該理解的是，本發明實施例所述方法僅僅是用于說明本發明，而不是對本發明的限制，在本發明的構思前提下對本發明制備方法的簡單改進都屬于本發明要求保護的范圍。實施例中用到的所有原料和溶劑均，如無特別說明，均為商購產品。

本發明所述微纖維膠原止血材料，通過下述一般性方法制備：

(1)原料處理：配制含有4％硫化鈉、40％乙醇濃度的脫毛劑，將脫毛機均勻涂抹于動物皮膚表面，2分鐘后使用刀片將動物皮膚表面的毛去除，清洗得到的無毛動物真皮；

(2)切碎、纖維化：將原材料用切割或研磨機將膠原制成粗纖維制品；

(3)溶脹控制：膠原進行機械粉碎或暴露在液體介質中時能為氫鍵提供更多的結合位點，這樣就導致了材料干燥時會角質化從而難以解聚成纖維或膨松化?？梢允褂糜袡C液體與水混溶作為水溶液，如低分子量醇、丙酮及類似物，如甲醇，乙醇，異丙醇，丁酮，丙酮等，有機液體與水比例從9：1至1：1，優選3：1的比例。其中，水的比例過高時，膠原纖維溶脹會為氫鍵提供過多的結合位點從而導致致密化。過度角質化和/或致密化會使得隨后的解聚與蓬松化難以達到所需的堆密度及表面積；

(4)干燥：采用抽真空氮氣保護加熱干燥或者冷凍真空干燥的方法制得膠原纖維束，避免干燥過程中膠原被氧化，抽真空氮氣保護加熱為在氮氣保護氛圍下60℃真空干燥22h。冷凍真空干燥過程如下：

a.產品預凍

開凍干機，先給前箱隔板降溫至-35℃以下，接著再給后箱冷凝器降溫至—60℃以下，然后抽真空、升溫，進入升華階段。

b.第一次升華

溫度由-35℃以下升至-25℃，溫度保持1h。

c.第二次升華

溫度由-25℃升溫至-15℃，溫度保持9h。

d.第三次升華

溫度由-15℃升至-5℃，溫度保持7h。

e.第四次升華

溫度由-5℃升至0，溫度保持5-6h。

f.升溫

溫度由0℃升至25℃，從開始升溫計時，保持2h。

(5)解聚、蓬松：將得到的纖維束使用錘磨機進行處理得到微纖維膠原產品。微纖維化膠原及其衍生物具有足夠的止血及粘合性能。

(6)微纖維膠原材料通過co⁶⁰25kg劑量輻照滅菌，可應用于臨床。

實施例1

1.采用含有4wt％硫化鈉、40vol％乙醇的脫毛劑將牛皮脫毛。

2.未加工牛真皮切成3.0cm正方狀，冷凍備用。

3.解凍1天，用2-8℃水溶液洗滌數次，排除多余水后，使用切割機將牛皮切成0.60-1.50cm的小片或小塊。

4.切好的小塊與碎冰混合再次通過切割機纖維化，使纖維化后的固體含量為35wt％，離心使固體含量為40wt％。

5.所有液體處理都在25-28℃之間進行。向12.5kg纖維化混合物加入37.5kg乙醇和200ml12n鹽酸(濃鹽酸)混合物。混合攪拌5h，離心使固體含量為50wt％。

6.向上述離心后混合物加入31.7kg乙醇和317g吐溫80混合物，混合攪拌3h,離心使固體含量為50wt％。

7.上述離心后混合物加入到47.5kg乙醇中，混合攪拌3h,離心使固體含量為50wt％。

8.抽真空氮氣保護條件下60℃干燥22h。

9.將抽真空氮氣干燥所得的纖維束使用錘磨機進行處理。

10.co⁶⁰25kg劑量輻照滅菌，得到所得產品。

實施例2

1.采用含有4wt％硫化鈉、40vol％乙醇的脫毛劑將牛皮脫毛，

2.未加工牛真皮切成3.0cm正方狀，冷凍備用。

3.解凍1天，用2-8℃水溶液洗滌數次，排除多余水后，使用切割機將牛皮切成0.60-1.50cm的小片或小塊。

4.切好的小塊與碎冰混合再次通過切割機纖維化，使纖維化后的固體含量為35％，離心使固體含量為40wt％。

5.所有液體處理都在25-28℃之間進行。向12.5kg纖維化混合物加入37.5kg乙醇和200ml12n鹽酸(濃鹽酸)混合物?；旌蠑嚢?h，離心使固體含量為50wt％。

6.向上述離心后混合物加入31.7kg乙醇和317g吐溫80混合物，混合攪拌3h，離心使固體含量為50wt％。

7.上述離心后混合物加入到47.5kg乙醇中，混合攪拌3h,離心使固體含量為50％。

8.冷凍真空干燥。

9.將真空冷凍干燥所得的纖維束使用錘磨機進行處理。

10.co⁶⁰25kg劑量輻照滅菌，得到所得產品。

止血效果研究：

取15只大鼠，按體重隨機分為3組，將大鼠麻醉，剖開腹部，擠出肝葉，用手術剪刀做“十”字創傷模型，分別使用紗布(a組)、avitene(b組)、新型微纖維膠原止血材料(c組)進行止血，使用材料后，覆蓋提前裁剪好的濾紙，帶濾紙充滿血后更換濾紙，分別記錄avitene、新型微纖維膠原止血材料、紗布的止血時間與出血量。

止血效果：將三組大鼠，分別使用紗布、avitene、新型微纖維膠原止血材料后記錄止血時間(見附圖1)與出血量(見附圖2)。由圖可知，使用微纖維膠原以及新型微纖維膠原止血材料的止血時間及出血量均要大大低于使用紗布來止血的大鼠，且新型微纖維膠原止血材料的止血時間以及出血量明顯短于微纖維膠原。avitene采用了干烤滅菌的方式，而本研究采用了鈷60照射滅菌，干烤相比γ射線，對于膠原結構的破壞更明顯，會顯著影響材料的吸水性、封閉傷口的能力，對止血效果形成較大影響。

由結果可以得到以下結論：新型微纖維膠原止血材料作為一種止血材料，其整體質量可控，止血效果良好。