背景技術(shù)：

1、膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后是不良的。對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(gbm)，無論是否治療，大多數(shù)患者僅能生存幾個月，并且中位生存期為11個月至12個月。僅有3％至8％的患者能存活超過3年。這些腫瘤呈彌漫性、浸潤性生長，通常無法進(jìn)行根治性切除并且對放射治療無效。血-腦屏障抑制包括現(xiàn)代治療(例如單克隆抗體、car-t)的大多數(shù)化合物穿透入腦。將藥物安全地并且有效地局部遞送至腦中是具有挑戰(zhàn)性的。此外，即使經(jīng)局部施用，活性成分也往往無法到達(dá)膠質(zhì)瘤深處位點(diǎn)并穿透整個腫瘤團(tuán)塊。

2、發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，他們包含cd45+白細(xì)胞的分離的靶向遞送系統(tǒng)能夠特異性地靶向腦內(nèi)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞并且發(fā)揮治療作用，所述cd45+白細(xì)胞包含鐵結(jié)合蛋白和活性成分的復(fù)合物。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的動物模型中，發(fā)明人示出了施用他們的包含抗癌藥物的分離的靶向遞送系統(tǒng)顯著的延長了生存期。

3、本發(fā)明的靶向遞送系統(tǒng)，其用于膠質(zhì)瘤的治療方法或診斷方法，相較于現(xiàn)有技術(shù)，除其他外其具有以下優(yōu)點(diǎn)：(i)將通常不能到達(dá)腦中的活性成分靶向遞送至膠質(zhì)瘤中；(ii)將活性成分靶向遞送至膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)，(iii)提高活性成分到膠質(zhì)瘤團(tuán)塊深處位點(diǎn)內(nèi)的穿透性，(iv)改善活性成分在膠質(zhì)瘤團(tuán)塊內(nèi)的分布，(v)保護(hù)活性成分免于其在血液循環(huán)中失活或從體內(nèi)清除，(vi)將藥代動力學(xué)差的活性成分遞送至腦中，(vii)由于直接靶向遞送降低了活性成分的毒性，(viii)由于直接靶向遞送和在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的局部沉積，以較低劑量的活性成分實(shí)現(xiàn)較高的治療效果；(ix)提高活性成分的全身施用的療效，從而防止了向腦內(nèi)局部遞送時(shí)組織損傷的風(fēng)險(xiǎn)；和/或(x)改善烷化藥物的治療效果和(xi)改善替莫唑胺(tmz)耐藥性腫瘤的治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及包含cd45+白細(xì)胞的分離的靶向遞送系統(tǒng)，其用于膠質(zhì)瘤的治療方法或診斷方法，所述細(xì)胞內(nèi)包含一種或多于一種鐵結(jié)合蛋白與藥物活性物質(zhì)、標(biāo)記物或藥物活性物質(zhì)和標(biāo)記物的復(fù)合物。

2、優(yōu)選實(shí)施方案的具體實(shí)施方式

3、在下文詳細(xì)描述本發(fā)明前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于本文所述的特定的方法、方案和試劑，因?yàn)檫@些方法、方案和試劑可以變化。還應(yīng)理解，本文使用的術(shù)語僅用于描述特定的實(shí)施方案，并且不旨在限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求書限制。除非另有定義，否則本文中使用的所有的技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語的含義與本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。

4、在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“肽”或“多肽”可互換使用，均指由肽鍵連接的至少兩個氨基酸的鏈。因此，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“多肽”也用于指具有超過50個、超過100個或超過150個氨基酸的氨基酸鏈。

5、術(shù)語“氨基酸”涵蓋了天然存在的氨基酸以及氨基酸衍生物。在本說明書的上下文中，氨基酸使用單字母代碼(hausman?re,cooper?gm(2004).the?cell:a?molecularapproach.washington,d.c:asm?press.p.51.isbn?978-0-87893-214-6)進(jìn)行標(biāo)識。用字母x標(biāo)識的氨基酸對應(yīng)于任意氨基酸。用字母b標(biāo)識的氨基酸對應(yīng)于d(天冬酰胺)或n(天冬氨酸)。用字母z標(biāo)識的氨基酸對應(yīng)于e(谷氨酰胺)或q(谷氨酸)。

6、在本文中，術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”可互換使用，均理解為由核苷酸單體構(gòu)成的聚合高分子或寡聚高分子。核苷酸單體由堿基、五碳糖(包括但不限于核糖或2’-脫氧核糖)和一個至三個磷酸基團(tuán)組成。通常，多核苷酸是通過單個核苷酸單體之間的磷酸二酯鍵形成的。在本發(fā)明的上下文中，所提及的核酸分子包括但不限于核糖核酸(rna)及其多種形式(例如但不限于ssrna、lna等)、脫氧核糖核酸(dna)、及其混合物，例如rna-dna雜交體。核酸可以通過例如化學(xué)方法合成，例如根據(jù)磷酸三酯法(參見例如，uhlmann,e.&peyman,a.(1990)chemical?reviews,90,543-584)。“適配體”是與多肽以高親和力結(jié)合的核酸。適配體可以通過如selemir146-a(參見例如jayasena(1999)clin.chem.,45,1628-50；klug?andfamulok(1994)m.mol.biol.rep.,20,97-107；us?5,582,981)的選擇方法從不同的單鏈rna分子的大型庫中分離。適配體也可以以其鏡像形式進(jìn)行合成和選擇，例如作為l-核糖核苷酸(nolte等人(1996)nat.biotechnol.,14,1116-9；klussmann等人(1996)nat.biotechnol.,14,1112-5)。以這種方式分離出來的形式具有不會被天然存在的核糖核酸酶降解的優(yōu)點(diǎn)，并且因此其具有更好的穩(wěn)定性。

7、本說明書全文使用術(shù)語“同一性”用于多肽序列和核苷酸序列的比較。在比較兩個序列且未指定用于計(jì)算序列同一性百分比的參考序列的情況下，如果沒有特別指明，否則應(yīng)以待比較的兩個序列中較長的序列為參考來計(jì)算序列同一性。如果指明了參考序列，如果沒有特別指明，則序列同一性將基于seq?id所指示的參考序列的全長來確定。例如，由200個氨基酸組成的多肽序列與300個氨基酸長的參考多肽序列相比較，可以呈現(xiàn)出的最大序列同一性百分比為66.6％(200/300)，而長度為150個氨基酸的序列可以呈現(xiàn)出的最大序列同一性百分比為50％(150/300)。如果這150個氨基酸中有15個氨基酸與300個氨基酸長的參考序列中相對應(yīng)的氨基酸不同，則序列一致性的水平降低至45％。核苷酸序列和氨基酸序列的相似性，即序列一致性的百分比，可以通過序列比對來確定。這種比對可以通過幾種本領(lǐng)域已知的算法進(jìn)行，優(yōu)選使用karlin和altschul的數(shù)學(xué)算法(karlin&altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa?90:5873-5877)、使用hmmalign(hmmer?package,http://hmmer.wustl.edu/)或使用clustal算法(thompson,j.d.,higgins,d.g.&gibson,t.j.(1994)nucleic?acids?res.22,4673-80)，其可以在例如http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw/或在http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html或在http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/npsa/npsa_clustalw.html上獲得。所使用的優(yōu)選參數(shù)是在http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw/或http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html上設(shè)置的默認(rèn)參數(shù)。序列同一性(序列匹配)的等級可以使用例如blast、blat或blastz(或blastx)進(jìn)行計(jì)算。blast蛋白質(zhì)搜索是通過blastp程序進(jìn)行的，得分(score)＝50，詞長(word?length)＝3。為了獲得用于比較目的的空位比對，采用了如altschul等人.?(1997)nucleic?acids?res.25:3389-3402所述的gapped?blast。在使用blast和gapped?blast程序時(shí)，使用各程序的默認(rèn)參數(shù)。序列匹配分析可以通過既定的同源定位技術(shù)進(jìn)行補(bǔ)充，如shuffle-lagan(brudno?m.,bioinformatics?2003b,19suppl1:i54-i62)或馬爾可夫隨機(jī)場。使用來自序列數(shù)據(jù)庫搜索的信息、還可以使用具有3d結(jié)構(gòu)的可獲得的同源物以及用戶定義約束對多個蛋白質(zhì)序列和/或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的比對(pei?j,grishin?nv:promals:towards?accurate?multiple?sequence?alignments?ofdistantly?related?proteins.bioinformatics2007,23:802-808；3dcoffee@igs:a?webserver?for?combining?sequences?and?structures?into?a?multiple?sequencealignment.poirot?o,suhre?k,abergel?c,o’toole?e,notredame?c.nucleic?acidsres.2004jul?1；32:w37-40.)。當(dāng)在本技術(shù)中提及序列同一性百分比時(shí)，如果沒有特別指明，則這些百分比是根據(jù)較長序列的全長來計(jì)算的。

8、在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“抗體”指的是屬于免疫球蛋白超家族的糖蛋白；術(shù)語抗體和術(shù)語免疫球蛋白經(jīng)常可以互換使用。抗體是指由漿細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子，并且其被免疫系統(tǒng)用來識別和中和如細(xì)菌和病毒的異物。抗體識別外來目標(biāo)的獨(dú)特部分，即其抗原。

9、如本文所用，術(shù)語“抗體片段”指的是保留特異性結(jié)合抗原能力的一個或多于一個抗體的片段。術(shù)語“抗體片段”所包含的結(jié)合片段的實(shí)例包括抗原結(jié)合片段(fab)、fab’片段、f(ab’)2片段、重鏈抗體、單域抗體(sdab)、單鏈可變區(qū)片段(scfv)、可變區(qū)片段(fv)、vh結(jié)構(gòu)域、vl結(jié)構(gòu)域、單域抗體、納米抗體、ignar(免疫球蛋白新抗原受體)、雙scfv、雙特異性t細(xì)胞銜接器(bite)、雙親和重定向(dart)分子、三抗體(triple?body)、雙抗體、單鏈雙抗體、替代支架蛋白(alternative?scaffold?protein)及其融合蛋白。

10、術(shù)語“抗原”用于指一種物質(zhì)，其優(yōu)選包含至少一個表位的免疫原性肽，優(yōu)選所述表位能引發(fā)b細(xì)胞反應(yīng)或t細(xì)胞反應(yīng)或b細(xì)胞反應(yīng)和t細(xì)胞反應(yīng)。

11、“表位”，也稱為抗原決定簇，是由免疫系統(tǒng)識別的物質(zhì)的一部分，例如免疫原性多肽的一部分。優(yōu)選地，這種識別是由抗體、b細(xì)胞或t細(xì)胞與所討論的表位結(jié)合來介導(dǎo)的。在此背景下，術(shù)語“結(jié)合”優(yōu)選與特異性結(jié)合相關(guān)。表位通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)組成，如氨基酸或糖側(cè)鏈，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。術(shù)語“表位”包括構(gòu)象表位和非構(gòu)象表位。構(gòu)象表位和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于，在變性溶劑存在時(shí)，會失去與前者的結(jié)合，而不會失去與后者的結(jié)合。

12、根據(jù)本發(fā)明，免疫原性多肽優(yōu)選衍生自選自病毒、細(xì)菌和原蟲的病原體。然而，在本發(fā)明的可替代的實(shí)施方案中，免疫原性多肽是腫瘤抗原，即癌癥特異性表達(dá)的多肽或多肽片段。

13、本說明書的全文中引用了幾份文件。本文引用的每一份文件(包括所有專利、專利申請、科學(xué)出版物、制造商說明書、說明書等)，無論是前文還是后文，均通過引用整體并入本文。本文的任何內(nèi)容均不應(yīng)被解釋為承認(rèn)本發(fā)明無權(quán)因現(xiàn)有發(fā)明而提前進(jìn)行此類公開。

14、在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，除非另有說明，否則將采用化學(xué)、生物化學(xué)和重組dna技術(shù)的常規(guī)方法，所述方法在該領(lǐng)域的文獻(xiàn)中有解釋(參見例如，molecular?cloning:a?laboratorymanual,2nd?edition,j.sambrook等人編輯,cold?spring?harbor?laboratory?press,cold?spring?harbor?1989)。

15、在本說明書以及隨后的權(quán)利要求書的全文中，除非上下文另有要求，否則詞語“包含/包括”及其變體應(yīng)理解為意指包括所述的整數(shù)或步驟或整數(shù)的組或步驟的組，但不排除任何其他得整數(shù)或步驟或整數(shù)的組或步驟的組。如本說明書和所附權(quán)利要求書中所用，名詞前無數(shù)量詞包括指代多個，除非上下文清楚地另外指明。

16、以下將對本發(fā)明的要素進(jìn)行描述。這些要素與具體實(shí)施方案一起列出，然而，應(yīng)當(dāng)理解，它們可以以任何方式和任何數(shù)量進(jìn)行組合以創(chuàng)建其他的實(shí)施方案。所述的各種實(shí)施例和優(yōu)選實(shí)施方案不應(yīng)被解釋為將本發(fā)明限制為僅明確描述的實(shí)施方案。本描述應(yīng)被理解為支持和包含那些將明確描述的實(shí)施方案與已公開要素和/或優(yōu)選要素中的任意數(shù)量相結(jié)合的實(shí)施方案。此外，除非上下文另有說明，否則應(yīng)認(rèn)為本技術(shù)的描述公開了本技術(shù)中描述的所有要素的任意排列和組合。

17、靶向遞送系統(tǒng)

18、本發(fā)明涉及包含cd45+白細(xì)胞的分離的靶向遞送系統(tǒng)，其用于膠質(zhì)瘤的治療方法或診斷方法，所述細(xì)胞內(nèi)包含一種或多于一種鐵結(jié)合蛋白與藥物活性物質(zhì)、標(biāo)記物或藥物活性物質(zhì)和標(biāo)記物的復(fù)合物。

19、如本文所用，術(shù)語“治療”包括醫(yī)學(xué)上允許的所有類型的預(yù)防性和/或治療性干預(yù)，用于治愈、暫時(shí)緩解、預(yù)防等目的，例如用于包括延緩或阻止疾病進(jìn)展、使病變消退或消失、預(yù)防發(fā)病或抑制復(fù)發(fā)等不同目的。在所提供的分離的靶向遞送系統(tǒng)用于膠質(zhì)瘤的治療方法的情況下，其包含藥物活性物質(zhì)。在所提供的分離的靶向遞送系統(tǒng)用于膠質(zhì)瘤的診斷方法的情況下，其包含標(biāo)記物。診斷方法是體內(nèi)診斷方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所提供的分離的靶向遞送系統(tǒng)用于膠質(zhì)瘤的治療方法。

20、術(shù)語“膠質(zhì)瘤”指的是腦神經(jīng)末梢周圍的膠質(zhì)細(xì)胞的癌癥。在優(yōu)選實(shí)施方案中，膠質(zhì)瘤為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。膠質(zhì)瘤或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤可以是原發(fā)性腫瘤或繼發(fā)性腫瘤。

21、在一些實(shí)施方案中，膠質(zhì)瘤對化學(xué)治療具有耐藥性。在一些實(shí)施方案中，膠質(zhì)瘤對使用烷化劑的化學(xué)治療具有耐藥性。在一些實(shí)施方案中，膠質(zhì)瘤為替莫唑胺(tmz)耐藥性膠質(zhì)瘤。在一些實(shí)施方案中，膠質(zhì)瘤表達(dá)o-6-甲基鳥嘌呤-dna甲基轉(zhuǎn)移酶(mgmt)。

22、tmz的治療效果取決于其將dna烷基化/甲基化的能力，所述烷基化/甲基化最常發(fā)生在鳥嘌呤殘基的n-7或o-6位置上。然而，一些腫瘤細(xì)胞能夠通過合成由o-6-甲基鳥嘌呤-dna甲基轉(zhuǎn)移酶(mgmt)基因編碼的蛋白質(zhì)來修復(fù)此類dna損傷，從而減弱tmz的療效。

23、出人意料地，發(fā)明人已證明，使用本發(fā)明的分離的靶向遞送系統(tǒng)、特別是包含鐵蛋白-藥物偶聯(lián)物、更特別是包含鐵蛋白-mmae偶聯(lián)物、甚至更特別是包含hft-vcmmae的分離的靶向遞送系統(tǒng)進(jìn)行治療，可以在體內(nèi)模型中顯著延長tmz耐藥性膠質(zhì)瘤的生存期。

24、在一些實(shí)施方案中，膠質(zhì)瘤為iii期膠質(zhì)瘤或iv期膠質(zhì)瘤(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)。在一些實(shí)施方案中，膠質(zhì)瘤為惡性膠質(zhì)瘤，如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或間變性星形細(xì)胞瘤。

25、在一些實(shí)施方案中，分離的靶向遞送系統(tǒng)用于在使用烷化劑治療期間或之后的正在經(jīng)歷疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)的人類個體的膠質(zhì)瘤的治療方法中，所述烷化劑特別是tmz。

26、在本說明書上下文中，術(shù)語“活性成分”用于指至少一種藥物活性物質(zhì)和/或至少一種標(biāo)記物。優(yōu)選地，活性成分為藥物活性物質(zhì)。

27、術(shù)語“靶向遞送”是指將治療劑或診斷劑(在本文中也統(tǒng)稱為“活性成分”)遞送至例如患者的對象，特別是遞送至細(xì)胞，更特別是直接遞送至患者體內(nèi)的細(xì)胞中。與單獨(dú)施用活性成分、施用鐵結(jié)合蛋白與活性成分的復(fù)合物、或施用其他遞送系統(tǒng)相比，靶向遞送使得活性成分在身體特定區(qū)域內(nèi)的濃度提高。特別地，與單獨(dú)施用活性成分、施用鐵結(jié)合蛋白與活性成分的復(fù)合物、或施用其他遞送系統(tǒng)相比，靶向遞送使得活性成分在腫瘤組織、特別是在膠質(zhì)瘤組織、更特別是在膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度增加。靶向遞送還包括“靶向診療遞送”，這意味著治療劑和診斷劑被同時(shí)遞送，優(yōu)選遞送至病變區(qū)域，從而能同時(shí)治療與診斷和/或治療監(jiān)測。

28、在優(yōu)選實(shí)施方案中，將活性成分直接遞送至膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)，優(yōu)選從cd45+白細(xì)胞直接轉(zhuǎn)移至膠質(zhì)瘤細(xì)胞(直接的細(xì)胞-細(xì)胞轉(zhuǎn)移)。直接轉(zhuǎn)移優(yōu)選通過涉及細(xì)胞-細(xì)胞接觸和/或細(xì)胞膜融合的機(jī)制。

29、在一些實(shí)施方案中，靶向遞送系統(tǒng)經(jīng)瘤內(nèi)注射施用。在一些實(shí)施方案中，靶向遞送系統(tǒng)經(jīng)靜脈注射施用。

30、本技術(shù)中使用的術(shù)語“靶向藥物活性物質(zhì)遞送系統(tǒng)”是指能夠?qū)⑺幬锘钚晕镔|(zhì)遞送至目標(biāo)區(qū)域的系統(tǒng)，即能夠在患者體內(nèi)進(jìn)行靶向遞送，優(yōu)選遞送至病變區(qū)域的系統(tǒng)。

31、本技術(shù)中使用的術(shù)語“靶向標(biāo)記物遞送系統(tǒng)”是指能夠?qū)?biāo)記物遞送至目標(biāo)區(qū)域的系統(tǒng)，即能夠在患者體內(nèi)進(jìn)行靶向遞送，優(yōu)選遞送至病變區(qū)域的系統(tǒng)。

32、本技術(shù)中使用的術(shù)語“靶向診療遞送系統(tǒng)”是指能夠?qū)⑺幬锘钚晕镔|(zhì)復(fù)合物和標(biāo)記物同時(shí)遞送至目標(biāo)區(qū)域的系統(tǒng)，即能夠在患者體內(nèi)進(jìn)行靶向遞送，優(yōu)選遞送至病變區(qū)域，從而允許同時(shí)進(jìn)行治療和診斷和/或治療監(jiān)測的系統(tǒng)。

33、術(shù)語“靶向遞送系統(tǒng)”通常用于指“靶向藥物活性物質(zhì)遞送系統(tǒng)”、“靶向標(biāo)記物遞送系統(tǒng)”和“靶向診療遞送系統(tǒng)”。wo2016207257a1、wo2016207256a1和wo2017222398a1中已對靶向遞送系統(tǒng)進(jìn)行了描述，其均通過引用并入本文。

34、復(fù)合物&接頭

35、在本發(fā)明的分離的靶向遞送系統(tǒng)中，活性成分可以共價(jià)結(jié)合或非共價(jià)結(jié)合至鐵結(jié)合蛋白，或也可被鐵結(jié)合蛋白或其多聚體包封。術(shù)語“復(fù)合物”還涵蓋活性成分被包圍在鐵結(jié)合蛋白或其多聚體、特別是形成“鐵蛋白籠”的鐵蛋白多聚體包封內(nèi)。在活性成分被鐵結(jié)合蛋白或其多聚體包封的情況下，包封可以在存在或不存在共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵的情況下發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，可以利用鐵蛋白大分子其本身的締合/離解特性，將活性成分包封在鐵蛋白寡聚物的內(nèi)部空腔中(物理限域)。在這些實(shí)施方案中，活性成分通過與空腔內(nèi)部表面的氨基酸殘基之間的非共價(jià)相互作用而被固定在適當(dāng)位置。血紅蛋白大分子還提供了非共價(jià)結(jié)合可以被容納在血紅蛋白自身的血紅素結(jié)合口袋中的經(jīng)選擇的藥物活性物質(zhì)和/或標(biāo)記物分子的可能性。口袋中的血紅素可以被具有合適的疏水性的藥物活性物質(zhì)和/或標(biāo)記物置換和取代。

36、當(dāng)cd45+白細(xì)胞內(nèi)化鐵結(jié)合蛋白時(shí)，復(fù)合物的形成使得活性成分被轉(zhuǎn)運(yùn)至cd45+白細(xì)胞中。因此，優(yōu)選的是活性成分以不干擾轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的方式與鐵結(jié)合蛋白結(jié)合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用本領(lǐng)域已知和wo2016207257a1、wo2016207256a1和wo2017222398a1中所述的吸收測定(uptake?assay)容易地進(jìn)行測試。如果包含活性成分的復(fù)合物被cd45+白細(xì)胞吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)至體內(nèi)的靶細(xì)胞，則優(yōu)選所述復(fù)合物是足夠穩(wěn)定的，以在細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)運(yùn)至體內(nèi)的目標(biāo)區(qū)域時(shí)存活。因此，優(yōu)選的是遞送復(fù)合物而不是單獨(dú)的活性成分，優(yōu)選至目標(biāo)區(qū)域中的靶細(xì)胞內(nèi)。這種特性還減少了活性成分對遞送所述活性成分的cd45+白細(xì)胞或體內(nèi)其他非靶細(xì)胞的細(xì)胞可能的有害影響，例如細(xì)胞毒性。

37、在優(yōu)選實(shí)施方案中，活性成分與鐵結(jié)合蛋白共價(jià)連接和/或非共價(jià)連接，優(yōu)選共價(jià)連接。如果活性成分與鐵結(jié)合蛋白共價(jià)連接，那么這種偶聯(lián)優(yōu)選通過位于鐵結(jié)合蛋白與參與胞吞作用的受體結(jié)合的不相關(guān)的表面區(qū)域中的氨基酸殘基來實(shí)現(xiàn)的。

38、在鐵結(jié)合蛋白與活性成分共價(jià)連接的情況下，它們可以是直接連接的或通過接頭，即間接連接的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，鐵結(jié)合蛋白與活性成分通過接頭共價(jià)連接。

39、接頭是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如聚丙氨酸、聚甘氨酸、碳水化合物、(ch2)n基團(tuán)或多肽接頭。接頭可以是可生物降解的或不可生物降解的，優(yōu)選可生物降解的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，接頭是可切割的。接頭可以是肽、二硫化物、或腙接頭或包含碳水化合物的接頭。優(yōu)選地，接頭是肽接頭。在一些實(shí)施方案中，肽接頭可被蛋白酶切割。包含碳水化合物的接頭可被β葡糖醛酸糖苷酶切割。腙接頭可通過酸水解被切割。二硫化物接頭可通過細(xì)胞質(zhì)還原裂解被切割。在優(yōu)選實(shí)施方案中，接頭、優(yōu)選肽接頭可以通過溶酶體蛋白酶、更優(yōu)選溶酶體半胱氨酸蛋白酶、甚至更優(yōu)選組織蛋白酶被切割。

40、在一些實(shí)施方案中，接頭包含活性基團(tuán)，所述活性基團(tuán)在受到特定刺激活化時(shí)會引發(fā)接頭內(nèi)部的共價(jià)鍵的斷裂。合適的活性基團(tuán)為例如光可活化基團(tuán)(即可以通過uv光活化的基團(tuán)，如3-氨基-3-(-2-硝基)苯基-丙酸或其光可活化結(jié)構(gòu)等效物)、連二亞硫酸鹽可活化基團(tuán)(如偶氮苯部分)或高碘酸鹽可活化基團(tuán)(如1,2-二羥基部分、1-氨基-2-羥基部分或4-氨基-4-脫氧-l-蘇糖酸)。在其他實(shí)施方案中，接頭可通過ph值變化切割。

41、通過適當(dāng)選擇苯腙、琥珀酰亞胺或馬來酰亞胺活化藥物，還可以將藥物活性物質(zhì)或標(biāo)記物共價(jià)結(jié)合至鐵結(jié)合蛋白的氨基酸側(cè)鏈(賴氨酸或半胱氨酸)上。苯腙衍生物可以斷裂并從鐵結(jié)合蛋白中釋放出藥物，賴氨酸結(jié)合衍生物在全部蛋白質(zhì)降解成氨基酸后可被激活，或半胱氨酸結(jié)合衍生物可通過馬來酰亞胺硫醚連接的還原水解在細(xì)胞內(nèi)被釋放。

42、在一些實(shí)施方案中，接頭是二肽接頭，特別是val-cit、val-ala或ala-ala，或三肽接頭和四肽接頭。

43、在一些實(shí)施方案中，接頭是含有n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)酯和馬來酰亞胺基團(tuán)的異-雙功能交聯(lián)劑，其使得含有胺的分子與含有巰基的分子共價(jià)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，接頭是琥珀酰亞胺基-4-(n-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(smcc)或磺基-smcc。

44、優(yōu)選可切割的接頭在溶酶體腔內(nèi)被切割。

45、在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，接頭是馬來酰亞胺己酰基-纈氨酸-瓜氨酸-對氨基芐氧基羰基(mc-vc-pab)接頭。

46、在一些實(shí)施方案中，鐵結(jié)合蛋白通過半胱氨酸殘基或賴氨酸殘基、優(yōu)選半胱氨酸殘基與活性成分或接頭偶聯(lián)。為了形成共價(jià)鍵，使用鐵結(jié)合蛋白的相關(guān)的巰基、氨基或羧基以將能與巰基或氨基反應(yīng)的活性成分直接地或間接地共價(jià)偶聯(lián)至鐵結(jié)合蛋白。活性成分可以通過特定的活性部分、即接頭進(jìn)行修飾。

47、因此，鐵蛋白或血紅蛋白可以與半胱氨酸巰基反應(yīng)性的藥物活性物質(zhì)和/或帶有基于肽的可切割的接頭(例如組織蛋白酶敏感的纈氨酸-瓜氨酸序列和對氨基芐基氨基甲酸酯間隔基)的標(biāo)記物相連接。已使用了作為值得注意的實(shí)例的抗有絲分裂劑單甲基澳瑞他汀e(mmae)。肽基接頭以穩(wěn)定的方式將蛋白質(zhì)與細(xì)胞毒性化合物結(jié)合，因此藥物在生理?xiàng)l件下不會輕易從蛋白質(zhì)中釋放，這有助于防止對健康細(xì)胞的毒性并確保劑量效率。由此生成的鐵結(jié)合蛋白藥物活性物質(zhì)和/或標(biāo)記物加合物分別能夠附著于選定的受體類型，例如血紅蛋白的cd163和運(yùn)鐵蛋白的tfr。一旦結(jié)合，鐵結(jié)合蛋白藥物活性物質(zhì)和/或標(biāo)記物加合物就會通過胞吞作用而被內(nèi)化，并且因此被細(xì)胞選擇性的吸收。含有活性成分的囊泡與溶酶體融合，并且，溶酶體半胱氨酸蛋白酶、特別是組織蛋白酶b開始分解可切割的肽接頭、特別是纈氨酸-瓜氨酸接頭，并且活性成分、特別是mmae不再與鐵結(jié)合蛋白結(jié)合，而是直接釋放到腫瘤環(huán)境中。

48、可替代地，dm1-smcc是帶有接頭的有效的美登木素(mertansine)衍生物，所述接頭與賴氨酸殘基特異性結(jié)合，在已成功描述的抗體的反應(yīng)中與鐵蛋白、血紅蛋白或運(yùn)鐵蛋白生成共價(jià)復(fù)合物。特別地，血紅蛋白、鐵蛋白或運(yùn)鐵蛋白可以與dm1-smcc反應(yīng)，從而提供可以在細(xì)胞內(nèi)裂解并以時(shí)間依賴性方式釋放活性藥物的共價(jià)的蛋白質(zhì)-藥物加合物。dm1對微管動力學(xué)的抑制會導(dǎo)致有絲分裂停滯和細(xì)胞死亡。

49、wo2016207257a1、wo2016207256a1和wo2017222398a1中描述了制備鐵結(jié)合蛋白和活性成分的復(fù)合物的方法。

50、在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“滿載(full?load)”用于指可以被cd45+白細(xì)胞、優(yōu)選巨噬細(xì)胞、更優(yōu)選活化的巨噬細(xì)胞所吸收的與藥物活性物質(zhì)、標(biāo)記物或藥物活性物質(zhì)和標(biāo)記物復(fù)合的鐵結(jié)合蛋白、優(yōu)選鐵蛋白的最大量。

51、還可以設(shè)想，在分離的靶向遞送系統(tǒng)中包含有不同的活性成分。例如，一種類型的活性成分可以共價(jià)結(jié)合鐵蛋白多肽，而另一種類型的活性成分則被包封在復(fù)合物中。這種方法利用了一旦遞送至靶組織和/或靶細(xì)胞的活性成分從復(fù)合物中不同的釋放速率。例如，通過利用相關(guān)的巰基、氨基或羧基的反應(yīng)性，可以將活性成分共價(jià)連接至鐵蛋白分子的24-聚體表面或其內(nèi)部空腔。這種有用的反應(yīng)的類型是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地將其應(yīng)用于特定的活性成分，而無需任何額外的工作。在behrens?cr,liub.methods?for?site-specific?drug?conjugation?to?antibodies.mabs.2014jan-feb；6(1):46-53中描述了這種反應(yīng)的實(shí)例。

52、在診療應(yīng)用中，即復(fù)合物同時(shí)包含標(biāo)記物和藥物活性物質(zhì)的情況下，優(yōu)選將標(biāo)記物共價(jià)連接至鐵結(jié)合蛋白上，而將藥物活性物質(zhì)非共價(jià)結(jié)合至鐵結(jié)合蛋白上和/或包封在鐵蛋白多肽的多聚體組裝時(shí)形成的內(nèi)部空腔中。

53、鐵結(jié)合蛋白

54、在一些實(shí)施方案中，鐵結(jié)合蛋白選自鐵蛋白，優(yōu)選重(h)型鐵蛋白、輕(l)鐵蛋白和/或線粒體鐵蛋白；血紅蛋白，優(yōu)選血紅蛋白a、血紅蛋白as、血紅蛋白sc、血紅蛋白c、血紅蛋白d、血紅蛋白e、血紅蛋白f、血紅蛋白h；血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物、血色素結(jié)合蛋白、運(yùn)鐵蛋白和乳鐵蛋白。

55、人運(yùn)鐵蛋白和鐵蛋白已被視為向特定靶向癌細(xì)胞遞送小分子或毒素偶聯(lián)物的有效載體。迄今為止，盡管人們做出了相當(dāng)大的努力，但尚未有成功的運(yùn)鐵蛋白或鐵蛋白的藥物復(fù)合物進(jìn)入臨床階段(luck?an等，2013，adv?drug?deliv?rev?65(8):1012-9)。

56、鐵蛋白是由24個鐵蛋白單體亞基組成的組裝成籠狀結(jié)構(gòu)的空心球狀蛋白質(zhì)復(fù)合物。鐵蛋白是主要的細(xì)胞內(nèi)鐵儲存蛋白。幾乎所有生物體可以生成鐵蛋白，并且其存在于每種細(xì)胞類型中。鐵蛋白基因在物種間是高度保守的。在脊椎動物中，存在兩種鐵蛋白單體：輕(l)鏈型和重(h)鏈型，其分子量分別為19kda或21kda。脊椎動物鐵蛋白的24-聚體可以是由l鏈或h鏈組成的同源寡聚體，也可以是由l鏈和h鏈共同組成的異源寡聚體(theil?ec,1987,annual?review?of?biochemistry.56(1):289-315)：典型的鐵蛋白復(fù)合物內(nèi)直徑和外直徑分別為約8nm和1約2nm。已示出，鐵蛋白在與cd71結(jié)合后通過胞吞作用內(nèi)化。鐵蛋白與cd71的相互作用是通過鐵蛋白-h鏈介導(dǎo)的(li?l等人，proc.natl.acad.sci.usa?107(8)(2010)3505-3510)。鐵蛋白在血漿中含量不豐富，但在例如大腸桿菌細(xì)胞的常見蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中作為重組蛋白質(zhì)可以容易地以高產(chǎn)率生成。

57、經(jīng)純化的運(yùn)鐵蛋白可以通過在細(xì)胞內(nèi)適當(dāng)釋放的共價(jià)接頭與包括抗癌藥物在內(nèi)的多種分子有效地偶聯(lián)(beyer?u等人.1998,j?med?chem41(15):2701-2708)。對于運(yùn)鐵蛋白，僅蛋白質(zhì)表面的賴氨酸基團(tuán)可以現(xiàn)成用于共價(jià)連接。

58、血紅蛋白曾因其與藥物化學(xué)偶聯(lián)的多樣性、在血液中的豐富性和相對穩(wěn)定性而被視為可能的藥物載體(somatogen,1993,wo1993008842?a1)。然而，由于缺乏受體靶向特性，除了作為血液替代品或抗鐮狀細(xì)胞劑外，并未促進(jìn)其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。事實(shí)上，hb只能被白細(xì)胞上的cd163(結(jié)合珠蛋白/血紅蛋白受體)表位識別，所述白細(xì)胞特別是單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞來源。本技術(shù)所述的基于cd45+白細(xì)胞、特別是基于巨噬細(xì)胞的蛋白質(zhì)遞送，將血紅蛋白作為藥物活性物質(zhì)和/或標(biāo)記物的靶向特異性載體推至舞臺中央。血紅蛋白可以容易地與合適的藥物活性物質(zhì)和/或標(biāo)記物、在血紅素結(jié)合口袋中容納的疏水性的藥物活性物質(zhì)和/或標(biāo)記物、或甚至是轉(zhuǎn)運(yùn)小分子、例如與血紅素鐵連接的細(xì)胞毒性分子共價(jià)連接。通過將合適的藥物偶聯(lián)物選擇性地附著至蛋白質(zhì)表面上唯一可滴定的半胱氨酸的β93半胱氨酸殘基上，可以容易地修飾hb。馬來酰亞胺功能化藥物，如微管蛋白抑制劑單甲基澳瑞他汀(mmae)或dna交聯(lián)藥物吡咯并苯二氮雜卓二聚體(pbd)，是可以容易地且特異性地附著至相關(guān)cysβ93殘基上的極強(qiáng)效細(xì)胞毒性劑的最顯著的實(shí)例。

59、可替代地，hb表面上的賴氨酸殘基(每個hb四聚體具有至少10個可滴定的賴氨酸殘基)可以容易地通過可切割的琥珀酰亞胺接頭進(jìn)行藥物偶聯(lián)。血紅蛋白還具有在酸性ph值下釋放非共價(jià)結(jié)合的血紅素基團(tuán)的獨(dú)特能力。由此獲得的未結(jié)合血紅素的血紅蛋白(apo-haemoglobin)能夠在空的血紅素口袋中容納幾個疏水分子，如紫杉醇的情況所示(meng?z等人.2015j?pharm?sci104(3):1045-55)，或用于具有熒光特性的標(biāo)記物(例如，二氫卟吩e6、金絲桃素、酞菁的衍生物)(dong?j等人.j?photochemphotobiol?b?2014,140:163-172)。

60、在本發(fā)明所述之用途的靶向遞送系統(tǒng)的優(yōu)選實(shí)施方案中，鐵結(jié)合蛋白選自鐵蛋白，優(yōu)選重(h)型鐵蛋白、輕(l)鐵蛋白和/或線粒體鐵蛋白；血紅蛋白，優(yōu)選血紅蛋白a、血紅蛋白as、血紅蛋白sc、血紅蛋白c、血紅蛋白d、血紅蛋白e、血紅蛋白f、血紅蛋白h；血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物、血色素結(jié)合蛋白、運(yùn)鐵蛋白；和乳鐵蛋白。術(shù)語鐵蛋白；血紅蛋白，優(yōu)選血紅蛋白a、血紅蛋白as、血紅蛋白sc、血紅蛋白c、血紅蛋白d、血紅蛋白e、血紅蛋白f、血紅蛋白h；血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物、血色素結(jié)合蛋白、運(yùn)鐵蛋白；和乳鐵蛋白涵蓋了天然存在的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變體，因此涉及具有相應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)結(jié)合一個或多于一個鐵離子的能力的至少70％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％、更優(yōu)選至少100％的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中所使用的鐵結(jié)合蛋白優(yōu)選來自哺乳動物，更優(yōu)選來自小鼠、大鼠、犬、猿，特別是黑猩猩、或人，最優(yōu)選來自人。wo2016207257a1公開了優(yōu)選的鐵結(jié)合蛋白和優(yōu)選的結(jié)構(gòu)變體的共有序列。

61、在優(yōu)選實(shí)施方案中，鐵結(jié)合蛋白為鐵蛋白，優(yōu)選為哺乳動物鐵蛋白。哺乳動物鐵蛋白可以是小鼠、大鼠、犬、猿、特別是黑猩猩、或人的鐵蛋白。在優(yōu)選實(shí)施方案中，哺乳動物鐵蛋白為小鼠、兔子、大鼠或人的鐵蛋白，優(yōu)選人的鐵蛋白。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，人的鐵蛋白為人的重鏈鐵蛋白。

62、鐵結(jié)合蛋白中的氨基酸置換優(yōu)選以不過度改變多肽構(gòu)象的方式進(jìn)行選擇。例如，“小氨基酸”應(yīng)該被另一小氨基酸置換。在本發(fā)明的上下文中“小氨基酸”優(yōu)選為分子量小于125道爾頓的氨基酸。在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的小氨基酸選自氨基酸甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸和纈氨酸、或其衍生物。另一個實(shí)例是，具有疏水側(cè)鏈的氨基酸應(yīng)被另一個具有疏水側(cè)鏈的氨基酸置換。

63、在根據(jù)本發(fā)明所述之用途的分離的靶向遞送系統(tǒng)中使用的任意鐵蛋白必須保留野生型鐵蛋白在復(fù)合物形成(由24個鐵蛋白單體亞基組成的籠狀結(jié)構(gòu))和鐵吸收方面的性質(zhì)。

64、在一些實(shí)施方案中，鐵蛋白包含與seq?id?no：1至seq?id?no：5中任一項(xiàng)具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列，并且具有野生型鐵蛋白的、特別是人野生型鐵蛋白的結(jié)合一個或多于一個鐵離子的能力和/或形成鐵蛋白24-聚體的能力的至少70％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％。seq?id?no：3是哺乳動物共有序列。在seq?id?no：3中，位置6的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選pro；位置14的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選his；位置16的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選asp；位置21的x可以存在或缺失，如果存在，則其表示任意氨基酸，優(yōu)選ile；位置29的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選tyr；位置81的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選phe；位置83的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選gln；位置105的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選his；位置144的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選ala或ser，更優(yōu)選ala；位置180的x缺失或?yàn)槿我馓烊淮嬖诘陌被幔瑑?yōu)選asn；位置181的x缺失或?yàn)槿我馓烊淮嬖诘陌被幔瑑?yōu)選glu；位置182的x缺失或?yàn)槿我馓烊淮嬖诘陌被幔瑑?yōu)選ser。seq?id?no：5是哺乳動物共有序列。在seq?id?no：5中，位置6的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選pro；位置14的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選his；位置16的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選asp；位置21的x可以存在或缺失，如果存在，則其表示任意氨基酸，優(yōu)選ile；位置22的x表示任意氨基酸，優(yōu)選asn；位置30的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選tyr；位置40的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選tyr或cys，更優(yōu)選為tyr；位置82的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選phe；位置84的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選gln；位置91的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選arg或cys，更優(yōu)選cys；位置106的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選his；位置110的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選asn或ser，更優(yōu)選asn；位置137的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選his或tyr，更優(yōu)選his；位置140的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選asn或ser，更優(yōu)選asn；位置145的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選ala或ser，更優(yōu)選ala；位置164的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選ala或ser，更優(yōu)選ser；位置166的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選met或leu，更優(yōu)選leu；位置178的x可以是任意天然存在的氨基酸，優(yōu)選asp或his，更優(yōu)選asp；位置181的x可以缺失或?yàn)槿我馓烊淮嬖诘陌被幔瑑?yōu)選asn；位置182的x可以缺失或?yàn)槿我馓烊淮嬖诘陌被幔瑑?yōu)選glu；位置183的x可以缺失或?yàn)槿我馓烊淮嬖诘陌被幔瑑?yōu)選ser。在一些實(shí)施方案中，鐵蛋白包含根據(jù)seq?id?no：4的氨基酸序列，其任選地在位置54、位置72、位置87和/或位置144之外、特別是在位置54之外包含1個至5個、1個至10個、1個至15個、1個至20個或1個至25個氨基酸突變，并且具有野生型鐵蛋白的、特別是人野生型鐵蛋白的結(jié)合一個或多于一個鐵離子的能力和/或形成鐵蛋白24-聚體、特別是形成鐵蛋白24-聚體的能力的至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％。

65、藥物和標(biāo)記物

66、在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“藥物”或“藥物活性物質(zhì)”可同義地使用，指的是任何能夠改變或調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的化合物，或者指能夠被激活以改變或調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的化合物，即前藥，優(yōu)選在患者體內(nèi)發(fā)揮作用。這類活性成分的實(shí)例包括所謂的“小分子”和肽。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“小分子”指的是具有低于1.500克/摩爾的分子量的碳?xì)浠衔锘蛩幬锘钚苑派湫酝凰亍?/p>

67、在優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物活性物質(zhì)為選自蛋白質(zhì)、肽、核酸、具有小于1.5kd的分子量的非蛋白質(zhì)非核酸化合物、光敏化合物、病毒和藥物活性放射性同位素的抗癌藥物。

68、優(yōu)選的藥物活性放射性同位素是發(fā)射α輻射或β輻射的放射性同位素，其還會發(fā)射細(xì)胞損傷的量的γ輻射，這些同位素選自镥-177、鐿-90、碘-131、釤-153、磷-32、銫-131、鈀-103、鐳-223、碘-125和硼-10，或者細(xì)胞損傷的量的α輻射，優(yōu)選選自錒-225、鉍-213、鉛-212和釙-212。還優(yōu)選上述化合物與同位素的復(fù)合物與納米顆粒(例如金、銀、石墨烯)或這些納米顆粒連接。

69、如果藥物活性物質(zhì)是病毒，則優(yōu)選為溶瘤病毒。

70、如果藥物是核酸，則優(yōu)選為mirna、sirna、經(jīng)化學(xué)修飾的rna、lna、ssrna、dna酶或編碼例如抗體、抗體模擬物、細(xì)胞因子、前藥轉(zhuǎn)化酶、免疫原性肽等藥物活性蛋白質(zhì)的核酸。

71、在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗癌藥物是細(xì)胞抑制藥物、細(xì)胞毒性藥物或其前藥。

72、優(yōu)選的抗癌藥物選自凋亡誘導(dǎo)藥物/自噬誘導(dǎo)藥物或壞死誘導(dǎo)藥物。凋亡誘導(dǎo)藥物/自噬誘導(dǎo)藥物或壞死誘導(dǎo)藥物可以是任何即使在細(xì)胞增殖異常的細(xì)胞中也能有效誘導(dǎo)凋亡/自噬或壞死的藥物。這些藥物優(yōu)選與一種或多于一種鐵蛋白形成復(fù)合物使用。

73、在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗癌藥物選自凋亡誘導(dǎo)藥物、烷化物質(zhì)、抗代謝物、抗生素、抗有絲分裂劑、dna修飾藥物、dna小溝鏈間交聯(lián)藥物(dna?minor?groove?interstrandcrosslinking?drug)、dna合成抑制劑、rna合成抑制劑、埃博霉素、核受體激動劑和核受體拮抗劑、抗雄激素、抗雌激素、鉑化合物、激素、抗激素、干擾素、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cdk)抑制劑、環(huán)氧合酶抑制劑和/或脂氧合酶抑制劑、生物脂肪酸(biogenic?fattyacid)、包括前列腺素類激素和白三烯的生物脂肪酸衍生物、蛋白激酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑、脂質(zhì)激酶抑制劑、鉑配位復(fù)合物(platinum?coordination?complex)、乙烯亞胺、甲基蜜胺(methylmelamine)、三嗪、長春花生物堿、嘧啶類似物、嘌呤類似物、烷基磺酸鹽/酯、葉酸類似物、蒽醌、經(jīng)取代的脲、和甲基肼衍生物、烯二炔抗生素、美登木素生物堿(maytansinoid)、澳瑞他汀衍生物、免疫檢查點(diǎn)抑制劑，和腫瘤特異性蛋白抑制劑或腫瘤特異性標(biāo)志物抑制劑，優(yōu)選rho-gdp解離抑制劑，更優(yōu)選grp94抑制劑或axl抑制劑、微管蛋白抑制劑或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。

74、在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗癌藥物選自醋地砜(acediasulfone)、阿克拉霉素(aclarubicine)、安巴腙、氨魯米特、l-天冬酰胺酶、澳瑞他汀、硫唑嘌呤、巴諾蒽醌、苯達(dá)莫司汀、博來霉素、白消安、甲酰四氫葉酸鈣、卡鉑、卡培他濱、卡莫司汀、塞來西布、卡利奇霉素(chaliceamycin)、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、放線菌素d(dactinomycin)、氨苯砜(dapsone)、柔紅霉素、德魯替康(deruxtecan)、雙溴丙脒、己烯雌酚、多西他賽、多柔比星、多拉司他汀10、多拉司他汀15、達(dá)內(nèi)霉素a、烯二炔類、表阿霉素(epirubicin)、埃坡霉素b、埃坡霉素d、磷酸雌莫司汀(estramucin?phosphate)、雌激素、炔雌醇、依托泊苷、依喜替康衍生物、夫拉平度(flavopiridol)、氟尿苷(floxuridine)、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、氟他胺(flutamide)、磷雌酚(fosfestrol)、呋喃唑酮、吉西他濱、促性腺激素釋放激素類似物、六甲蜜胺、羥基脲、羥甲基呋喃妥因(hydroxymethylnitrofurantoin)、己酸羥孕酮(hydroxyprogesteronecaproat)、羥基脲、伊達(dá)比星、碘苷、異環(huán)磷酰胺、干擾素α、伊立替康、亮丙瑞林、洛莫司汀、勒托替康(lurtotecan)、磺胺米隆磺酰胺(mafenide?sulfate?olamide)、美登素(maytansine)、氮芥、醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone?acetate)、醋酸甲地孕酮(megastrolacetate)、美法侖(melphalan)、米帕林(mepacrine)、巰嘌呤、美登木素、甲氨蝶呤、甲硝唑、絲裂霉素c、米托肼(mitopodozide)、米托坦、米托蒽醌、光輝霉素、萘啶酸、新制癌菌素(neocazinostatin)、硝呋太爾(nifuratel)、硝呋齊特(nifuroxazide)、呋喃拉嗪(nifuralazine)、硝呋莫司、尼莫司汀、尼莫拉唑、呋喃妥因、氮芥類、奧羅莫星(oleomucin)、噁喹酸、噴他脒、噴司他丁、非那吡啶、酞磺胺噻唑、哌泊溴烷、潑尼莫司汀、潑尼松、普雷辛(preussin)、甲基芐肼、乙胺嘧啶、吡咯并苯二氮雜卓(pyrrolobenzodiazepine)、雷替曲塞、雷帕霉素、羅非昔布、羅格列酮、柳氮磺吡啶、氯化斯克利伐寧(scriflavinium?chloride)、司莫司汀(semustine)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、sn-38、磺胺脲、磺胺醋酰、磺胺氯噠嗪、磺胺嘧啶、磺胺戊烯、磺胺二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine)、磺胺乙二唑(sulfaethidole)、磺胺異噁唑、磺胺胍、磺胺胍諾、磺胺甲噻二唑、磺胺甲噁唑、復(fù)方新諾明、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺二甲唑(sulfamoxole)、磺胺、磺胺培林、磺胺苯吡唑、磺胺噻唑、磺胺索嘧啶、星形孢菌素、他莫昔芬、紫杉醇、替尼泊苷、特替泊苷(tertiposide)、睪酮內(nèi)酯、丙酸睪酮、硫鳥嘌呤、噻替哌、替硝唑、拓?fù)涮婵怠⑷齺啺孵⑶鷬W舒凡、甲氧芐啶、氯乙環(huán)磷酰胺、ucn-01、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春堿、長春瑞濱和佐柔比星(zorubicin)。更優(yōu)選地，抗癌藥物選自澳瑞他汀、巴諾蒽醌、苯達(dá)莫司汀、苯丁酸氮芥、卡利奇霉素、達(dá)內(nèi)霉素a、美登素、美法侖、美登木素、新制癌菌素和吡咯并苯二氮雜卓。

75、甚至更優(yōu)選地，抗癌藥物為澳瑞他汀，特別是單甲基澳瑞他汀e或單甲基澳瑞他汀f，或德魯替康。

76、在一些實(shí)施方案中，抗癌藥物是免疫調(diào)節(jié)藥物，能夠激活或抑制免疫細(xì)胞的活化，優(yōu)選地，所述免疫調(diào)節(jié)藥物是模式識別受體的配體或拮抗劑，特別是toll樣受體、nod樣受體(nlr)、rig-i樣受體(rlr)或干擾素基因刺激因子(sting)蛋白的配體或拮抗劑。從生理學(xué)角度來看，這些受體能夠識別被稱為病原體相關(guān)分子模式(pamp)和損傷相關(guān)分子模式(damp)的信號類別。

77、在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗癌藥物是增殖抑制蛋白或增殖抑制肽，優(yōu)選為細(xì)胞周期抑制劑、或特異性結(jié)合增殖促進(jìn)蛋白的抗體或抗體樣結(jié)合蛋白，或核酸，優(yōu)選編碼增殖抑制蛋白或特異性結(jié)合增殖促進(jìn)蛋白的抗體或抗體樣結(jié)合蛋白的核酸，或sirna、寡核苷酸、lna或dna酶。

78、在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“前藥”指任何在施用后經(jīng)代謝或以其他方式轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)活性或針對至少一種特性而言活性更高的成分(或藥物)的活性成分。與藥物相比，前藥進(jìn)行了化學(xué)修飾，使其相對于藥物而言活性較低或無活性，但這種化學(xué)修飾使得在將前藥向患者施用后，其能夠通過代謝過程或其他生物學(xué)過程生成相應(yīng)的藥物。例如，前藥相對于活性藥物可以具有改變的代謝穩(wěn)定性或傳輸特征、較少的副作用或較低的毒性、或改善的氣味(例如參見參考文獻(xiàn)nogrady,1985,medicinal?chemistry?a?biochemicalapproach,oxford?university?press,new?york,pages?388-392，通過引用并入本文)。前藥可以使用除相應(yīng)的藥物以外的反應(yīng)物來合成。

79、在一些實(shí)施方案中，藥物活性物質(zhì)是缺氧激活前藥，優(yōu)選選自苯并三嗪n-氧化物、阿帕齊醌(eo9)、替拉扎明(tpn)、sn30000、pr-104a、th-302、th-4000和aq4n。在缺氧條件下激活的活性成分的使用可以進(jìn)一步增加靶向的特異性和/或進(jìn)一步降低活性成分的不良反應(yīng)。因此，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，活性成分是缺氧激活前藥。所有缺氧激活前藥的主鏈?zhǔn)谴嬖谖宸N不同的化學(xué)部分(硝基、奎寧、芳香族n-氧化物和脂肪族n-氧化物和過渡金屬)中的一種，其在組織中的缺氧條件下經(jīng)酶促還原。缺氧激活前藥是任何相對于相應(yīng)的藥物活性較低或無活性的前藥，并且包含藥物和一種或多于一種可生物還原基團(tuán)。這種缺氧激活前藥包括所有能由各種還原劑和還原酶激活的前藥，所述還原酶包括但不限于單電子轉(zhuǎn)移酶(如細(xì)胞色素p450還原酶)和雙電子轉(zhuǎn)移(或氫化物轉(zhuǎn)移)酶。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，缺氧激活前藥為th-302。pct申請wo?07/002931和wo?08/083101中描述了th-302的合成方法。

80、在一些實(shí)施方案中，藥物活性物質(zhì)是抗原或編碼抗原的核酸。

81、本文所使用的術(shù)語“標(biāo)記物”或“診斷劑”可互換使用，指任何適用于診斷目的的化合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記物選自熒光染料、放射性同位素/熒光發(fā)射同位素、可檢測多肽或編碼可檢測多肽的核酸和造影劑，或者，其中標(biāo)記物包含與二價(jià)金屬陽離子或三價(jià)金屬陽離子形成復(fù)合物的螯合劑。更優(yōu)選地，標(biāo)記物選自熒光染料、放射性同位素和造影劑。造影劑是有助于顯示體內(nèi)的異常區(qū)域的染料或其他物質(zhì)。

82、優(yōu)選的熒光染料選自以下類別的熒光染料：呫噸類(例如熒光素)、吖啶類(例如吖啶黃)、噁嗪類(例如噁嗪1)、花菁類(例如cy7/cy3)、苯乙烯染料(例如染料-28)、香豆素類(例如alexa?fluor?350)、卟吩類(例如葉綠素b)、金屬配體復(fù)合物(例如ptoepk)、熒光蛋白(例如apc、r-藻紅蛋白)、納米晶體(例如quantumdot?705)、苝類(例如lumogen?red?f300)和酞菁類(例如irdyetm700dx)，以及這些染料類別的偶聯(lián)物和組合物。

83、優(yōu)選的放射性同位素/熒光發(fā)射同位素選自α輻射發(fā)射同位素、γ輻射發(fā)射同位素、俄歇電子發(fā)射同位素、x射線發(fā)射同位素、熒光同位素，如65tb，熒光發(fā)射同位素，如18f、51cr、67ga、68ga、89zr、111in、99mtc、140la、175yb、153sm、166ho、88y、90y、149pm、177lu、47sc、142pr、159gd、212bi、72as、72se、97ru、109pd、105rh、101m15rh、119sb、128ba、123i、124i、131i、197hg、211at、169eu、203pb、212pb、64cu、67cu、188re、186re、198au和199ag，以及以上同位素與蛋白質(zhì)、肽、小分子抑制劑、抗體或其他化合物的偶聯(lián)物和組合物(例如18f-fdg、89zr-氧化物或64cu-卟啉(porfirin))。

84、優(yōu)選的可檢測多肽是自發(fā)熒光蛋白，優(yōu)選綠色熒光蛋白或其任意具有改變的吸收光譜和/或發(fā)射光譜的結(jié)構(gòu)變體。

85、優(yōu)選的造影劑選自順磁劑，例如gd、eu、w和mn，優(yōu)選與螯合劑復(fù)合。其他選擇為超順磁性鐵(fe)復(fù)合物和超順磁性鐵(fe)顆粒、含有高原子序數(shù)原子的化合物，即用于計(jì)算機(jī)斷層掃描術(shù)(ct)的碘，含有這些造影劑的微泡和載體，如脂質(zhì)體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記物包含與二價(jià)金屬陽離子或三價(jià)金屬陽離子形成復(fù)合物的螯合劑。

86、優(yōu)選的螯合劑選自1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-n,n’,n,n’-四乙酸(dota)、乙二胺四乙酸(edta)、1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸(nota)、三乙烯四胺(teta)、亞氨基二乙酸、二乙烯三胺-n,n,n’,n’,n”-五乙酸(dtpa)和6-肼基吡啶-3-羧酸(hynic)。

87、白細(xì)胞

88、給定細(xì)胞或其細(xì)胞群內(nèi)化鐵蛋白的能力取決于參與此內(nèi)化過程的受體的表達(dá)。導(dǎo)致鐵蛋白內(nèi)化的受體包括例如，tfr、cxcr4、清道夫受體、cd163和tim-2。技術(shù)人員非常清楚如何測量鐵蛋白吸收的量，優(yōu)選的吸收量測量方法將在下文的實(shí)施例部分中描述。

89、在本發(fā)明的上下文中所使用的術(shù)語“白細(xì)胞”(leukocyte或leukocyte?cell是指免疫系統(tǒng)中涉及保護(hù)身體免于傳染病和外來侵入物的細(xì)胞。所有白細(xì)胞均由骨髓中的多能細(xì)胞、稱為造血干細(xì)胞生成并衍生而來。白細(xì)胞遍布全身，包括血液系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)。所有白細(xì)胞都具有細(xì)胞核，這將它們與其他血細(xì)胞、即無核紅細(xì)胞(rbc)和血小板區(qū)分開來。白細(xì)胞的類型可以按標(biāo)準(zhǔn)方式進(jìn)行分類。最廣泛的兩對類別是通過結(jié)構(gòu)(粒細(xì)胞或無粒細(xì)胞)或細(xì)胞分裂譜系(髓系細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞)來對它們進(jìn)行分類的。這些最廣泛的類別可以還分為五種主要類型：中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。這些類型的細(xì)胞通過它們的物理特征和功能特征進(jìn)行區(qū)分。單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是吞噬細(xì)胞。還可以分類為亞型；例如，在淋巴細(xì)胞中，有b細(xì)胞、t細(xì)胞和nk細(xì)胞。粒細(xì)胞與無粒細(xì)胞的區(qū)別在于它們的細(xì)胞核形狀(分葉狀與圓形，即多形核與單核)以及在于它們的細(xì)胞質(zhì)顆粒(存在或不存在，或者更準(zhǔn)確地說，在光學(xué)顯微鏡下可見或不可見)。另一種分類方法是按譜系：通過造血細(xì)胞譜系(細(xì)胞分化譜系)將髓系細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)與淋巴樣細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)進(jìn)行區(qū)分。

90、cd45的表達(dá)是白細(xì)胞亞群、即單核細(xì)胞、單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、nk細(xì)胞的特征，這些細(xì)胞適用于在本發(fā)明的上下文中所述的靶向遞送系統(tǒng)，特別是因?yàn)閏d45+白細(xì)胞會被吸引到體內(nèi)特定的組織和細(xì)胞中，并能夠向細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)遞送一種或多于一種鐵結(jié)合蛋白和一種與多于一種的藥物活性物質(zhì)、標(biāo)記物或藥物活性物質(zhì)和標(biāo)記物的復(fù)合物。下文將該亞群的白細(xì)胞稱為“cd45+白細(xì)胞”。優(yōu)選地，單核細(xì)胞不是樹突狀細(xì)胞，其分化受以下一種或多于一種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控：ifn調(diào)節(jié)因子8(irf8)、核因子白細(xì)胞介素(il)-3-調(diào)節(jié)蛋白(nfil3)、堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子atf樣3(batf3)或轉(zhuǎn)錄因子relb(nf-κb亞基)-relb、spi-1原癌基因(pu/1)、重組無毛結(jié)合蛋白抑制子(rbpj)、ifn-調(diào)節(jié)因子4(irf4)或轉(zhuǎn)錄因子e2-2(也稱為tcf4)。

91、技術(shù)人員理解，上文所定義的cd45+白細(xì)胞除非是克隆起源，否則是表達(dá)cd45表面抗原這一共同特性的不同白細(xì)胞的混合群體。因此，本說明書全文通過進(jìn)一步的功能特征和/或結(jié)構(gòu)特征來表征上文所定義的cd45+白細(xì)胞多樣化群體中的細(xì)胞亞群。術(shù)語“cd45+”表示細(xì)胞群體中的大多數(shù)細(xì)胞或基本上所有細(xì)胞表達(dá)cd45表面抗原。

92、在此方面，“表達(dá)”的意思是細(xì)胞群體中的大多數(shù)細(xì)胞或基本上所有細(xì)胞均表達(dá)所述標(biāo)志物(本文中也稱為表面抗原)。在此背景下并參考其他細(xì)胞表面抗原，術(shù)語“表達(dá)”表示所述表面抗原在細(xì)胞內(nèi)生成并可在細(xì)胞表面暴露而被檢測到。不同細(xì)胞之間表面抗原的表達(dá)水平和可檢測的細(xì)胞表面暴露的抗原數(shù)量可以差異很大。通常，對于細(xì)胞表面抗原而言，如果表面抗原的至少5個拷貝、優(yōu)選至少10個拷貝是可檢測地暴露在細(xì)胞表面，則認(rèn)為該細(xì)胞呈陽性，即表示為“+”。技術(shù)人員熟知如何檢測、定量并選擇對給定細(xì)胞表面抗原呈陽性(或陰性)的細(xì)胞。優(yōu)選的方法包括熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(facs)。在這項(xiàng)技術(shù)中，使用熒光標(biāo)記的抗體與細(xì)胞群中的細(xì)胞表面抗原結(jié)合，隨后將細(xì)胞分離成單個細(xì)胞，并根據(jù)單個細(xì)胞的熒光強(qiáng)度測量結(jié)果，判斷其對給定細(xì)胞表面抗原是否呈陽性或陰性。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中指明了給定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平是高還是低。這意味著在兩種情況下表達(dá)的蛋白質(zhì)均可檢測，即為“+”，然而，水平不同。對于不同的蛋白質(zhì)，高表達(dá)和低表達(dá)分別意味著每個細(xì)胞中蛋白質(zhì)的絕對數(shù)量不同。因此，如果每個細(xì)胞中有超過500個可檢測的該蛋白質(zhì)的拷貝，則認(rèn)為給定蛋白質(zhì)表達(dá)水平高，而如果每個細(xì)胞中有1個至50個可檢測的該蛋白質(zhì)的拷貝，則認(rèn)為給定蛋白質(zhì)表達(dá)水平低。然而，對于另一種蛋白質(zhì)，如果每個細(xì)胞中有超過5000個可檢測的拷貝，則認(rèn)為其表達(dá)水平高，而如果每個細(xì)胞中有1個至500個可檢測的拷貝，則認(rèn)為其表達(dá)水平低。本領(lǐng)域眾所周知如何使用流式細(xì)胞術(shù)和becton?dickinsonquantibritetm微珠法(參見例如pannu,k.k.,2001,cytometry.2001dec?1；45(4):250-8)或質(zhì)譜法(參見例如milo,r.,2013,bioessays,35(12):1050-1055)來定量細(xì)胞表達(dá)或生成的蛋白質(zhì)數(shù)量。

93、對于本發(fā)明的目的，術(shù)語給定蛋白質(zhì)的“高表達(dá)”指該蛋白質(zhì)的可檢測表達(dá)為在健康的細(xì)胞群體、特別是cd45+白細(xì)胞群體中已發(fā)現(xiàn)的最高表達(dá)水平、即每個細(xì)胞的拷貝數(shù)的至少70％。術(shù)語給定蛋白質(zhì)的“低表達(dá)”指該給定蛋白質(zhì)的可檢測表達(dá)為在健康的細(xì)胞群體、特別是cd45+白細(xì)胞群體中已發(fā)現(xiàn)的最高表達(dá)水平、即每個細(xì)胞的拷貝數(shù)的30％或低于30％。優(yōu)選地，“最高表達(dá)水平”被確定為不同對象的健康細(xì)胞、特別是cd45+白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的最高表達(dá)水平的平均值。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選的細(xì)胞亞群的特征在于“生成”給定蛋白質(zhì)。這理解為意味著所述蛋白質(zhì)不必要在細(xì)胞表面上是可檢測的，而可以僅存在于細(xì)胞內(nèi)部。技術(shù)人員熟知如何檢測和/或定量細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的生成，和/或如何選擇生成這類蛋白質(zhì)的細(xì)胞。可替代地，可以通過給定轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來定義細(xì)胞群。本領(lǐng)域眾所周知如何確定在細(xì)胞群或甚至是單個細(xì)胞中的給定蛋白質(zhì)或其編碼mrna的表達(dá)，例如，使用抗體進(jìn)行體內(nèi)標(biāo)記、fish測定、單獨(dú)使用體內(nèi)單分子熒光顯微鏡(crawford,r.等人.biophys?j.(2013)105(11):2439)或與熒光激活細(xì)胞分選(facs)結(jié)合使用、或者通過primeflow技術(shù)(ebioscience)(adam?s.venable,等人，(2015)methods?in?molecular?biology)。

94、在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“分化的單核細(xì)胞”用于指由稱為巨噬細(xì)胞-dc前體(mdp)的定向前體分化的單核細(xì)胞，所述前體主要存在于骨髓中(但也可以在脾臟中)，并分化為樹突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。在小鼠中，它們由兩個主要的亞群組成：(i)具有cx3cr1高表達(dá)、ccr2和ly6c-低表達(dá)的cd11b+細(xì)胞和(ii)具有cx3cr1低表達(dá)、ccr2和ly6c+高表達(dá)的cd11b+細(xì)胞。在離開骨髓后，小鼠的ly6c+單核細(xì)胞在循環(huán)中分化為ly6c-單核細(xì)胞。類似地，在人單核細(xì)胞的分化中，普遍認(rèn)為cd14++經(jīng)典單核細(xì)胞離開骨髓并在外周血液循環(huán)中分化為cd14++cd16+中間單核細(xì)胞，并繼而分化為cd14+cd16++非經(jīng)典單核細(xì)胞(yang等人.2014；biomark?res?2(1)doi.10.1186/2050-7771-2-1)。優(yōu)選地，分化的單核細(xì)胞不是樹突狀細(xì)胞，其分化受以下一種或多于一種轉(zhuǎn)錄因子控制：irf8、nfil3、batf3、relb、pu/1、rbpj、iirf4和/或tcf4，并且更優(yōu)選地，不是樹突狀細(xì)胞。

95、巨噬細(xì)胞是組織駐留的專業(yè)吞噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(apc)，其從循環(huán)外周血單核細(xì)胞(pbm)分化。本發(fā)明的上下文中使用術(shù)語“活化的巨噬細(xì)胞”指任何極化的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞的活化通常是通過用白細(xì)胞介素、細(xì)胞因子和/或生長因子孵育來實(shí)現(xiàn)的。特別地，il-4和m-csf可以用作活化劑。不同表型的活化的巨噬細(xì)胞分為m1型巨噬細(xì)胞，經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(cam)，和m2型巨噬細(xì)胞，替代性活化的巨噬細(xì)胞(aam)。經(jīng)典活化的m1型巨噬細(xì)胞包括具有急性炎癥表型的免疫效應(yīng)細(xì)胞。這些細(xì)胞對細(xì)菌是高度侵襲的，并生成大量的淋巴因子(murray和wynn,2011,j?leukocbiol,89(4):557-63)。替代性活化的、抗炎m2型巨噬細(xì)胞可以至少分為三個亞組。這些亞型具有各種不同的功能，其包括免疫調(diào)節(jié)、維持耐受性和組織修復(fù)/傷口愈合。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“m1誘導(dǎo)劑”是指能引導(dǎo)pbm分化為m1型巨噬細(xì)胞的化合物。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“m2誘導(dǎo)劑”是指能引導(dǎo)pbm分化為m2型巨噬細(xì)胞的化合物。技術(shù)人員知道大量的促進(jìn)分化為m1型巨噬細(xì)胞或m2型巨噬細(xì)胞的方法。術(shù)語“巨噬細(xì)胞吞噬”是指巨噬細(xì)胞吞噬固體顆粒以形成稱為吞噬體的內(nèi)部囊泡的過程。表述“病毒的/細(xì)菌的/真菌的/蠕蟲的蛋白質(zhì)或產(chǎn)物”是指在病毒/細(xì)菌/真菌/蠕蟲感染期間由病毒、細(xì)菌、真菌或蠕蟲生成或來源其的分子。

96、根據(jù)本發(fā)明所述之用途的靶向遞送系統(tǒng)中包含的cd45+白細(xì)胞可從cd34+造血前體細(xì)胞中生成。

97、在優(yōu)選實(shí)施方案中，cd45+白細(xì)胞選自單核細(xì)胞、分化的單核細(xì)胞，優(yōu)選巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞。優(yōu)選地，cd45+白細(xì)胞為巨噬細(xì)胞，更優(yōu)選為活化的巨噬細(xì)胞。

98、對于單核細(xì)胞，其優(yōu)選為cd11b+單核細(xì)胞，優(yōu)選選自cd11b+cd14+單核細(xì)胞、cd11b+cd16+單核細(xì)胞、cd11b+cd14+cd16+單核細(xì)胞、cd11b+cd14+hla-dr單核細(xì)胞、cd11b+cd14+cd115+單核細(xì)胞、cd11b+cd14+單核細(xì)胞、cd11b+cd16+單核細(xì)胞、cd11b+ccr1+單核細(xì)胞、cd11b+ccr2+單核細(xì)胞、cd11b+cx3cr+單核細(xì)胞、cd11b+cxr4+單核細(xì)胞、cd11b+cxr6+單核細(xì)胞和cd11b+cd14+cd33+單核細(xì)胞。

99、對于分化的單核細(xì)胞，其優(yōu)選選自巨噬細(xì)胞、活化的巨噬細(xì)胞，優(yōu)選cd11b+巨噬細(xì)胞，更優(yōu)選cd11b+cd16+巨噬細(xì)胞、cd11b+cd32+巨噬細(xì)胞、cd11b+cd64+巨噬細(xì)胞、cd11b+cd68+巨噬細(xì)胞、優(yōu)選cd11b+cd86+m1型巨噬細(xì)胞，其優(yōu)選生成inos和/或分泌白細(xì)胞介素12(il-12)，或優(yōu)選cd11b+ccr2+m2型巨噬細(xì)胞、cd11b+cd204+m2型巨噬細(xì)胞、cd11b+cd206+m2型巨噬細(xì)胞、cd11b+cd204+cd206+m2型巨噬細(xì)胞、cd11b+hla-dr+m2型巨噬細(xì)胞、cd11b+cd200r+m2型巨噬細(xì)胞、cd11b+cd163+m2型巨噬細(xì)胞、或生成精氨酸酶和/或分泌白細(xì)胞介素10(il-10)的活化的巨噬細(xì)胞；和樹突狀細(xì)胞(dc)，優(yōu)選cd11b+cd11c+dc、cd11b+cd80+dc、cd11c+cd80+dc、cd11c+cd86+dc、cd11c+hla-dr+dc或cd11c+cd123+dc，優(yōu)選分化的單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞不是lox1+、cxcr7+和nrf2+泡沫細(xì)胞。

100、在一些實(shí)施方案中，巨噬細(xì)胞為未分化的巨噬細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，巨噬細(xì)胞為初始巨噬細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，巨噬細(xì)胞為m0型巨噬細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，巨噬細(xì)胞向m2輕度極化。在一些實(shí)施方案中，巨噬細(xì)胞為m2型巨噬細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道由m2型巨噬細(xì)胞或向m2輕度極化的巨噬細(xì)胞所表達(dá)的表面標(biāo)志物。

101、優(yōu)選地，分化的單核細(xì)胞表達(dá)至少一種趨化因子受體，其優(yōu)選選自ccr1、ccr2、cxcr4和cxcr6，或至少一種生長因子受體，其優(yōu)選選自巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體(cd115)、粒細(xì)胞集落刺激因子受體(cd114)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體(cd116和cd131)。

102、在優(yōu)選實(shí)施方案中，單核細(xì)胞或分化的單核細(xì)胞：

103、(i)能夠由cd34+造血前體細(xì)胞生成；

104、(ii)能夠通過將單核細(xì)胞用至少一種誘導(dǎo)劑、優(yōu)選m1誘導(dǎo)劑或m2誘導(dǎo)劑、更優(yōu)選至少一種m2誘導(dǎo)劑進(jìn)行體外孵育生成；

105、(iii)其特征在于表達(dá)以下抗原中的至少一種：tfr、cd163、cd14、cd16、cd33、cxcr4、25f9、hla-dr和/或cd115和任選的cd172a和/或cxcr4，特別是tfr、cd163、cd14、cd16、cd33、25f9、cd172a和/或cd115中的至少一種，或tfr、cd163、cd14、cd16、cxcr4、25f9和/或cxcr1中的至少一種；和/或

106、(iv)具有吞噬能力。

107、優(yōu)選地，

108、(i)m1誘導(dǎo)劑選自lps、gm-csf、inf-γ、病毒的蛋白質(zhì)或產(chǎn)物或細(xì)菌的蛋白質(zhì)或產(chǎn)物；

109、(ii)m2誘導(dǎo)劑選自il-4、il-10、il-13、抗原和抗體的免疫復(fù)合物、igg、熱激活的γ-球蛋白、糖皮質(zhì)激素、tgf-β、il-1r、ccl-2、il-6、m-csf、pparγ激動劑、白細(xì)胞抑制因子、癌癥條件培養(yǎng)基、癌細(xì)胞、腺苷和蠕蟲的蛋白質(zhì)或產(chǎn)物或真菌的蛋白質(zhì)或產(chǎn)物。

110、在優(yōu)選實(shí)施方案中，活化的巨噬細(xì)胞：

111、(i)能夠通過將單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞用能夠改變巨噬細(xì)胞上表達(dá)標(biāo)志物的因子進(jìn)行體外孵育生成，優(yōu)選地，

112、(a)用至少一種m1誘導(dǎo)劑，

113、(b)用至少一種m2誘導(dǎo)劑，或

114、(c)用能夠改變巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、趨化因子和/或生成inos、精氨酸酶或其他免疫調(diào)節(jié)酶的能力的因子，所述細(xì)胞因子優(yōu)選il-10和il-12；

115、(ii)其特征在于表達(dá)以下抗原中的至少一種：cd64、cd86、cd16、cd32、hla-dr，和/或生成inos和/或il-12；

116、(iii)能夠通過將單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞用能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬能力的因子進(jìn)行體外孵育生成；

117、(iv)其特征在于表達(dá)以下抗原中的至少一種：cd204、cd206、cd200r；ccr2、運(yùn)鐵蛋白受體(tfr)、cxc趨化因子受體4(cxcr4)、cd163，和/或示出hla-dr的低表達(dá)；

118、(v)具有吞噬能力；和/或

119、(vi)能夠分泌細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子優(yōu)選il-12或il-10，或生成誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inos)、促炎化合物、精氨酸酶免疫抑制化合物或抗炎化合物。

120、優(yōu)選地，

121、(i)m1誘導(dǎo)劑選自lps、inf-γ、gm-csf和病毒的蛋白質(zhì)或產(chǎn)物或細(xì)菌的蛋白質(zhì)或產(chǎn)物；或

122、(ii)m2誘導(dǎo)劑選自il-4、il-10、il-13、抗原和抗體的免疫復(fù)合物、igg、熱激活的γ-球蛋白、糖皮質(zhì)激素、tgf-β、il-1r、ccl-2、il-6、m-csf、pparγ激動劑、白細(xì)胞抑制因子、腺苷、蠕蟲的蛋白質(zhì)或產(chǎn)物或真菌的蛋白質(zhì)或產(chǎn)物。

123、優(yōu)選地，分化的單核細(xì)胞，優(yōu)選巨噬細(xì)胞，其特征在于表達(dá)tfr、cd163、cd14、cd16、cd33、25f9、cd172a和/或cd115中的至少一種、至少兩種、至少三種、優(yōu)選至少四種、至少五種、更優(yōu)選至少六種、至少七種或全部，或表達(dá)tfr、cd163、cd14、cd16、cxcr4、25f9和/或cxcr1中的至少一種、至少兩種、至少三種、優(yōu)選至少四種、至少五種、更優(yōu)選至少六種、至少七種或全部。

124、對于淋巴細(xì)胞，其優(yōu)選選自cd3+和cd4+cd8+t淋巴細(xì)胞、或cd19+b淋巴細(xì)胞、cd20+b淋巴細(xì)胞、cd21+b淋巴細(xì)胞、cd19+cd20+b淋巴細(xì)胞、cd19+cd21+b淋巴細(xì)胞、cd20+cd21+b淋巴細(xì)胞、或cd19+cd20+cd21+b淋巴細(xì)胞，和自然殺傷(nk)細(xì)胞。

125、在本發(fā)明的靶向遞送系統(tǒng)的優(yōu)選實(shí)施方案中，淋巴細(xì)胞：

126、(i)能夠從血液、脾臟或骨髓中獲得，或者能夠由cd34+前體細(xì)胞生成，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且在例如lefort和kim,2010,j?vis?exp?40:2017；tassone和fidler,2012,methods?in?molecular?biology?882:351-357；kouro等人.2005,current?protocols?inimmunology,66:f22f.1:22f.1.1-22f.1.9.中也有描述；

127、(ii)是免疫活性淋巴細(xì)胞；

128、(iii)表達(dá)抗原特異性t細(xì)胞受體；和/或

129、(iv)其特征在于表達(dá)以下抗原中的至少一種：(a)cd3和cd4或cd8，或(b)：cd19、cd20、cd21、cd19?cd20、cd19?cd21、cd20?cd21或cd19?cd20?cd21抗原，并且其優(yōu)選能夠生成免疫球蛋白。

130、在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，cd45+淋巴細(xì)胞是nk細(xì)胞，其

131、(i)能夠從血液、脾臟或骨髓中獲得，或能夠由cd34+前體細(xì)胞生成；和/或

132、(ii)其特征在于缺少cd3表達(dá)，并表達(dá)以下的至少一種：cd56+和/或cd94+、cd158a+cd158f+cd314+cd335+。

133、關(guān)于粒細(xì)胞，其優(yōu)選選自中性粒細(xì)胞，優(yōu)選cd66b+中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，優(yōu)選cd193+嗜酸性粒細(xì)胞。

134、在本發(fā)明的靶向遞送系統(tǒng)的優(yōu)選實(shí)施方案中，粒細(xì)胞：

135、(i)能夠從血液、脾臟或骨髓中獲得，或能夠由cd34+前體細(xì)胞生成，例如在kuhs等人.2015,currprotocimmunol?111:7.23-1-7.23.16；coquery等人.2012,cytometry?a?81(9):806-814；swemydas和lionakis?2013,j?vis?exp?77:50586中所述；

136、(ii)其特征在于表達(dá)以下的至少一種：cd66b和/或cd193；

137、(iii)是多形核白細(xì)胞，其特征在于其細(xì)胞質(zhì)中存在顆粒；和/或

138、(iii)其特征在于表達(dá)以下的至少一種：tfr、cd163、tim-2和/或cxcr4。

139、在細(xì)胞群中，只要該細(xì)胞群中的大多數(shù)細(xì)胞具備特性，即便不是每一個細(xì)胞都具備該特性，本發(fā)明所述之用途的靶向遞送系統(tǒng)仍然提供所列出的優(yōu)點(diǎn)。因此，在下文中描述了本發(fā)明所述之用途的靶向遞送系統(tǒng)的一個優(yōu)選細(xì)胞的特性。

140、在優(yōu)選實(shí)施方案中，包含在本發(fā)明靶向遞送系統(tǒng)中的cd45+白細(xì)胞、優(yōu)選巨噬細(xì)胞來源于分離的外周血單個核細(xì)胞(pbmc)。優(yōu)選地，包含在靶向遞送系統(tǒng)中的cd45+白細(xì)胞、優(yōu)選巨噬細(xì)胞是原代細(xì)胞，即從人體組織、特別是外周血中直接分離的細(xì)胞。優(yōu)選地，包含在靶向遞送系統(tǒng)中的cd45+白細(xì)胞、優(yōu)選巨噬細(xì)胞不是永生化細(xì)胞系的細(xì)胞。

141、在一些實(shí)施方案中，包含在靶向遞送系統(tǒng)中的cd45+白細(xì)胞來源于待治療的患者。在這種情況下，負(fù)載復(fù)合物的細(xì)胞對患者來說是自體的。還設(shè)想到，在使用本發(fā)明的靶向遞送系統(tǒng)進(jìn)行治療之前對患者進(jìn)行hla分型，并且用于特定患者的細(xì)胞類型與患者是hla匹配的。在這兩種優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞是原代細(xì)胞或由原代細(xì)胞經(jīng)過少數(shù)分化步驟衍生出的。可替代地，細(xì)胞可以來自永生化細(xì)胞系，但優(yōu)選非轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。

142、用于分離cd45+白細(xì)胞的血液優(yōu)選從待治療的患者中或健康的供者中獲得。可替代地，血液也可以從血庫中獲得。本文也考慮了臍帶血的使用。

143、wo2016207257a1、wo2016207256a1和wo2017222398a1中描述了將鐵結(jié)合蛋白和活性成分的復(fù)合物負(fù)載至cd45+白細(xì)胞的方法。

144、機(jī)制

145、本發(fā)明利用負(fù)載了與藥物/前藥連接的鐵結(jié)合蛋白的cd45+白細(xì)胞、優(yōu)選活化的巨噬細(xì)胞作為靶向膠質(zhì)瘤的遞送系統(tǒng)。膠質(zhì)瘤對化療反應(yīng)不理想或難以通過影像方法檢測，主要與血-腦屏障導(dǎo)致抗癌藥物對腫瘤的滲透性降低有關(guān)。然而，本發(fā)明用于治療膠質(zhì)瘤的靶向遞送系統(tǒng)的cd45+白細(xì)胞、優(yōu)選活化的巨噬細(xì)胞，能夠穿過血-腦屏障遷移至膠質(zhì)瘤區(qū)域。在腦內(nèi)，增加的腫瘤內(nèi)部組織間隙液壓和血瘤屏障阻礙了治療劑向膠質(zhì)瘤的穿透。本發(fā)明中用于治療膠質(zhì)瘤的靶向遞送系統(tǒng)的cd45+白細(xì)胞，優(yōu)選活化的巨噬細(xì)胞，能夠到達(dá)腫瘤更深處的位點(diǎn)。與局部施用藥物或在與鐵結(jié)合蛋白復(fù)合物中的藥物相比，當(dāng)經(jīng)局部施用時(shí)，本發(fā)明的靶向遞送系統(tǒng)可確保藥物在腫瘤組織內(nèi)更好地分布。綜上所述，本發(fā)明的靶向遞送系統(tǒng)構(gòu)成了將活性成分遞送至整個膠質(zhì)瘤團(tuán)塊的有效的遞送系統(tǒng)。

146、發(fā)明人觀察到，在將根據(jù)本發(fā)明所述之用途的分離的靶向遞送系統(tǒng)經(jīng)靜脈或經(jīng)瘤內(nèi)施用于動物后，負(fù)載的cd45+白細(xì)胞、優(yōu)選活化的巨噬細(xì)胞會遷移至膠質(zhì)瘤位點(diǎn)并將鐵結(jié)合蛋白與一種或多于一種活性成分的復(fù)合物釋放至癌細(xì)胞中(圖3、圖4和圖8)。發(fā)明人證實(shí)，細(xì)胞-細(xì)胞接觸對于將包含鐵蛋白和活性成分的復(fù)合物、特別是偶聯(lián)物從巨噬細(xì)胞有效轉(zhuǎn)移至癌細(xì)胞中是必需的，并且巨噬細(xì)胞分泌包含鐵蛋白和活性成分的復(fù)合物、特別是偶聯(lián)物并隨后被癌細(xì)胞吸收不足以確保有效的遞送(圖5和圖6)。這表明，本發(fā)明的靶向遞送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移是細(xì)胞間的直接轉(zhuǎn)移，需要cd45+白細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)和癌細(xì)胞之間的細(xì)胞-細(xì)胞接觸或至少非常接近。這種直接轉(zhuǎn)移的優(yōu)點(diǎn)在于活性劑能夠特異性地遞送至靶細(xì)胞內(nèi)，而不會增加腦內(nèi)的腫瘤細(xì)胞外部的細(xì)胞外濃度，從而提高療效并減少副作用。因此，本發(fā)明的方法可以將活性成分精確地遞送至膠質(zhì)瘤位點(diǎn)、特別是膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)。

147、聯(lián)合治療

148、在根據(jù)本發(fā)明所述之用途的分離的靶向遞送系統(tǒng)的一些實(shí)施方案中，膠質(zhì)瘤的治療或診斷包括在施用分離的靶向遞送系統(tǒng)之前對膠質(zhì)瘤進(jìn)行輻照。

149、發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在侵襲性膠質(zhì)瘤模型中，包括輻照膠質(zhì)瘤和隨后施用靶向遞送系統(tǒng)的聯(lián)合治療進(jìn)一步提高了小鼠的生存率(實(shí)施例3，表5和表6)。輻照后，注射包含鐵蛋白-藥物偶聯(lián)物的巨噬細(xì)胞可顯著延長生存期，并且比單獨(dú)注射鐵蛋白-藥物偶聯(lián)物更有效(實(shí)施例3，表6)。

150、聯(lián)合輻照和隨后施用靶向遞送系統(tǒng)的有益效果不僅限于膠質(zhì)瘤，還適用于其他癌癥。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了包含cd45+白細(xì)胞的分離的靶向遞送系統(tǒng)，其用于膠質(zhì)瘤的治療方法或診斷方法，所述細(xì)胞內(nèi)包含一種或多于一種鐵結(jié)合蛋白與藥物活性物質(zhì)、標(biāo)記物或藥物活性物質(zhì)和標(biāo)記物的復(fù)合物，其中膠質(zhì)瘤的治療或診斷包括在施用分離的靶向遞送系統(tǒng)之前對膠質(zhì)瘤進(jìn)行輻照。關(guān)于膠質(zhì)瘤的治療或診斷所述的涉及優(yōu)選的cd45+白細(xì)胞、復(fù)合物形成方式、鐵結(jié)合蛋白、藥物活性物質(zhì)和標(biāo)記物的所有實(shí)施方案也適用于與癌癥的治療或診斷相關(guān)的方面。

151、藥物組合物

152、在另一方面，本發(fā)明提供了用于治療或診斷膠質(zhì)瘤的藥物組合物，其包含關(guān)于本發(fā)明的第一方面所述的分離的靶向遞送系統(tǒng)以及藥學(xué)上可接受的載劑和/或合適的一種或多于一種賦形劑。關(guān)于本發(fā)明的第一方面所述的所有實(shí)施方案也適用于該藥物組合物。

153、由于分離的靶向遞送系統(tǒng)包含活細(xì)胞，因此優(yōu)選選擇能夠保持細(xì)胞存活的載劑和賦形劑。

154、“藥學(xué)上可接受的”指的是經(jīng)聯(lián)邦政府或州政府的監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或在美國藥典或其他公認(rèn)的藥典中列舉的用于動物、更特別用于人的。

155、如本文所用，術(shù)語“載劑”是指藥物非活性物質(zhì)，例如但不限于與藥學(xué)活性物質(zhì)一起施用的稀釋劑、賦形劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、生理緩沖液或載劑。這類藥物載劑可以是液體或固體。液體載劑包括但不限于無菌液體，如鹽水水溶液和油類，所述油類包括但不限于石油來源、動物來源、植物來源或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。鹽水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油水溶液也可用作液體載劑，特別是用于可注射溶液。當(dāng)藥物組合物經(jīng)靜脈施用時(shí)，鹽水溶液是優(yōu)選的載劑。e.w.martin所著的“remington’spharmaceutical?sciences”中描述了合適的藥物載劑的實(shí)例。

156、合適的藥物“賦形劑”包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。

157、“表面活性劑”包括陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑，例如但不限于脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉、triton?x-100和聚山梨酯，如聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯65和聚山梨酯80。

158、“穩(wěn)定劑”包括但不限于甘露醇、蔗糖、海藻糖、白蛋白，以及蛋白酶拮抗劑和/或核酸酶拮抗劑。

159、“生理緩沖液”包括但不限于氯化鈉溶液、去離子水以及合適的有機(jī)緩沖或無機(jī)緩沖液，例如但不限于磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、tris緩沖液(三(羥甲基)氨基甲烷)、hepes緩沖液([4-(2-羥乙基)哌嗪]乙磺酸)或mops緩沖液(3-嗎啉代-1-丙磺酸)。相應(yīng)的緩沖液的選擇通常取決于期望的緩沖液摩爾濃度。例如，磷酸鹽緩沖液適用于注射溶液和輸注溶液。

160、治療方法

161、在另一方面，本發(fā)明提供了膠質(zhì)瘤的治療方法或診斷方法，其包括向有需要的患者施用有效量的關(guān)于本發(fā)明第一方面所述的分離的靶向遞送系統(tǒng)。關(guān)于本發(fā)明第一方面所述的所有實(shí)施方案也適用于所述治療方法或診斷方法。