本發明特別涉及一種具備光學層析能力的小型化掃描顯微體積成像探頭及成像系統，屬于光學三維顯微成像、生物醫學光學與光子學、醫用成像器械。

背景技術：

1、目前臨床中常用的診斷病理學技術，包括組織病理學和術中冰凍病理，本質上都是有創的離體觀測手段，易出現采樣偏差，且無法提供實時動態信息。下一代診斷病理學呼喚能夠直接對原位在體組織實施高時空分辨率、三維結構與功能可視化的成像設備，但現有的小型化手持式成像探頭有各自的局限：

2、1)常規的寬場反射光(或散射光)內窺鏡只能拍攝組織表面的顏色與紋理，無法深入皮下成像；即使引入熒光信號，其落照式激發模式也無法區分在焦信號和離焦背景，缺乏深度層析(即光學切片)和三維分辨能力；

3、2)光學相干斷層掃描(optical?coherence?tomography，oct)成像模態具備深度層析和三維成像能力，然而其空間分辨率一般在5-10微米量級，且圖像對比度來源于組織的背向散射光，無法提供有效的細胞級別的組織微觀結構；

4、3)共聚焦或者雙光子熒光等點掃描成像模態具備微米級別的空間分辨率和深度層析能力，但受逐點掃描的模式限制，其二維幀率最多有數十幀每秒。在此基礎上即使引入軸向掃描，能達到的三維體成像(即堆疊數十至上百張源自不同深度的二維圖像以形成三維體積數據)速率(以下簡稱體幀率)也十分有限(典型值為0.1-1體積/秒)；如果再要通過平移成像探頭探查更大范圍的三維組織，則耗時更久。考慮到活體組織中難免存在由于呼吸、心跳或其他因素引起的不規則運動，前述有限的三維體幀率使得成像結果易受運動偽影的干擾，使得所采集的體數據存在不規則的三維變形，以及使得相鄰的兩組體數據無法配準等。

5、活體顯微成像領域對高時空分辨率的孜孜以求催生了近年來新興的共焦斜光片掃描(swept?confocally-aligned?planar?excitation，scape)顯微鏡。scape顯微技術巧妙利用了高性能顯微物鏡充裕的孔徑角，使用單個物鏡生成相對于主光軸傾斜的照明光束片，并收集該斜光片所激發的(背向)熒光——由此將常規光片顯微鏡的激發物鏡與探測物鏡合二為一，在繼承了光片顯微成像本征的光學層析能力與低光毒性優勢的同時，更提供了開放的樣本空間，可以兼容不同尺寸的模式動物和各種活體成像場景，天然適配前視式成像探頭的光路架構。更重要的是，其共焦探測模式能在無需移動物鏡或樣品的前提下完成三維層析掃描，規避了機械移動主物鏡固有的速度瓶頸和對活體樣本的擾動，其三維體積成像速度理論上可達上千體積/秒。

6、然而現有的標準臺式共焦斜光片掃描顯微鏡體積龐大，且核心光路高度復雜，要將其小型化至適合原位在體病理學成像應用的輕便、靈活、易操控的細長硬管形顯微成像探頭，在光學原理上面臨兩點突出困難：(一)標準臺式共焦斜光片掃描顯微鏡依賴共軛于主物鏡后焦面的檢流計振鏡驅動斜光片掃描，使得整體光路以振鏡為拐點呈90度彎折，這與臨床應用所需的緊湊細長的外形是不相容的；(二)標準臺式共焦斜光片掃描顯微鏡需要將重建于第二物鏡焦點區的中間圖像直接放大到科研級cmos相機上進行采樣記錄，使得前端成像探頭難以與體積龐大的相機在物理上分離，極大制約了手持式探頭部分的輕便性和易用性。

7、綜上，掃描斜光片顯微成像技術因其開放的樣本空間、高分辨率和高速三維成像(高體積率)等優勢，在活體無標記、無創、實時原位在體病理學成像方面有巨大的應用潛力，但其現有的臺式架構和設計思路無法簡單遷移到小型化、輕便靈活、細長硬管形的手持式顯微(以及顯微內窺)成像探頭設計。如何跳出臺式共焦斜光片掃描顯微鏡的設計常規，在體積小巧、細長硬管形的成像探頭框架下實現高時空分辨三維顯微體積成像，從而在不破壞活體組織及其生理環境的前提下，高靈敏、高分辨地可視化表皮下組織的三維微觀結構與功能動態，達到“無需切片、勝似切片”的原位病理學成像效果，對促進精準診療和推進健康中國建設都具有重要意義。

技術實現思路

1、本發明的主要目的在于提供一種小型化掃描顯微體積成像探頭及成像系統，通過原理架構和采集策略層面的創新，解決了將共焦斜光片掃描顯微鏡小型化所面臨的兩點核心困難，使得在小型化、細長硬管形顯微(或內窺顯微)成像探頭上實現高時空分辨、三維顯微體積成像成為可能，從而克服現有技術中的不足。

2、為實現前述發明目的，本發明采用的技術方案包括：

3、本發明一方面提供了一種小型化掃描顯微體積成像探頭，包括：

4、微型光片產生單元或者微型光針產生單元，所述微型光片產生單元用于將源自光源模塊的照明光束轉換為二維的光片形態，所述微型光針產生單元用于將源自光源模塊的照明光束轉換為光針形態；

5、成像光路，用于將源自光源模塊的照明光束傳輸至成像樣本，以及，收集所述成像樣本發出的背向信號光束并將所述背向信號光束重建形成中間圖像；

6、掃描引擎，用于控制和改變所述照明光束在所述成像樣本中的位置、驅動所述照明光束進行掃描運動以及驅動探測到的所述背向信號光束進行掃描運動；

7、中間圖像采集器，用于接收所述中間圖像，并對所述中間圖像進行像素化處理。

8、在一較為典型的實施案例中，所述掃描引擎包括第一掃描引擎和/或第二掃描引擎，所述第一掃描引擎與所述微型光片產生單元、所述中間圖像采集器配合，所述第一掃描引擎用于驅使所述微型光片產生單元、所述中間圖像采集器同步進行一維掃描運動，所述第二掃描引擎與所述成像光路配合，所述第二掃描引擎用于驅使所述照明光束、所述背向信號光束進行一維掃描運動。

9、進一步的，所述第一掃描引擎為一維掃描引擎或二維掃描引擎。

10、進一步的，所述第一掃描引擎包括壓電驅動器、偏轉方向相互垂直的一對壓電雙晶片或彎曲片、具有相互垂直的兩對表面電極的壓電晶體管或者基于微機電系統、線性或旋轉電機的掃描裝置。

11、進一步的，所述第二掃描引擎包括設置在所述成像光路內部的至少一組棱鏡對，所述棱鏡對包括兩個同軸設置的棱鏡，該兩個所述棱鏡能夠繞自身中軸線發生相對偏轉，而驅使所述照明光束、所述背向信號光束進行一維掃描運動。

12、進一步的，所述棱鏡為楔形棱鏡。

13、更進一步的，所述棱鏡對所包含的兩個所述棱鏡的楔角相同或不同。

14、更進一步的，所述棱鏡對所包含的兩個所述棱鏡的材質相同。

15、進一步的，當所述第二掃描引擎驅使所述照明光束、所述背向信號光束進行平動掃描時，所述棱鏡對所包含的兩個所述棱鏡的旋轉角速度相同而旋轉方向相反。

16、進一步的，所述微型光片產生單元包括光片產生組件，所述光片產生組件用于將所述照明光束直接整形形成光片形態。

17、進一步的，所述光片產生組件包括聚焦元件、具有光束整形功能的衍射光學元件、超表面元件中的至少一者。

18、進一步的，所述聚焦元件包括柱面透鏡。

19、進一步的，所述柱面透鏡包括球面柱面鏡、雙膠合柱面鏡、三膠合柱面鏡或非球面柱面鏡。

20、進一步的，所述微型光片產生單元還包括光片角度調節元件，所述光片產生組件和所述光片角度調節元件依次設置在所述照明光束的光路上，所述光片角度調節元件用于調整所述照明光束入射至所述成像光路的入射角度。

21、進一步的，所述光片角度調節元件包括反射鏡和/或多邊形棱鏡。

22、進一步的，所述聚焦元件與所述光片角度調節元件設置為一體。

23、在一較為具體的實施案例中，所述微型光片產生單元包括光針生成組件和第三掃描引擎，所述光針生成組件用于將所述照明光束整形為光針形態，所述第三掃描引擎與所述光針生成組件傳動連接，并用于驅使所述光針生成組件選定方向進行掃描，并形成虛擬的光片形態。

24、作為一種典型的實施案例，所述光針生成組件包括反射鏡，所述反射鏡用于反射照明光束，以使反射后的照明光束的主光線與虛擬的光片形態的照明光束的傳播方向平行，反射后的照明光束的等效光腰被鏡像到所述中間圖像采集器的斜切接收端面上。

25、作為另一種典型的實施案例，所述光針生成組件包括光束整形組件和反射鏡，所述光束整形組件用于改變照明光束的形態參數，以將照明光束整形形成光針形態，所述形態參數包括數值孔徑、束腰直徑、瑞利長度中的至少一者，所述反射鏡用于反射經光束整形組件整形后的照明光束，反射后的照明光束的等效光腰被鏡像到所述中間圖像采集器的斜切接收端面上。

26、進一步的，光針形態的照明光束形態包括“長直形”或“彎曲狀”，需要說明的是，本發明中的光針形態的照明光束一般是一維的。

27、進一步的，光針形態的照明光束包括高斯光束、貝塞爾光束或貝塞爾-高斯光束或艾里光束。

28、更進一步的，所述光束整形組件包括至少一個光束整形透鏡；優選的，所述光束整形透鏡包括雙凸透鏡、具有雙凹、平凸或雙凸球面或非球面面型的單透鏡、消色差透鏡、漸變折射率透鏡中的至少一者。

29、作為一種典型的實施案例，光針形態的照明光束為貝塞爾-高斯光束，所述光束整形組件包括錐透鏡、具有軸棱錐全息相位的衍射光學元件、超表面透鏡中的至少一者，或者，所述光束整形組件是由準直透鏡、漸變折射率透鏡、漸變折射率光纖、微型球面或非球面透鏡中的至少一者與錐透鏡、具有軸棱錐全息相位的衍射光學元件、超表面透鏡中的至少一者組合形成的，或者，所述光束整形組件是一個以上的具有軸棱錐全息相位的衍射光學元件和/或超表面透鏡組合形成的。

30、作為一種典型的實施案例，光針形態的照明光束為艾里光束，所述光束整形組件具有三次相位結構的相位掩膜版，或者，所述光束整形組件主要是由準直透鏡、漸變折射率透鏡、漸變折射率光纖、微型球面或非球面透鏡、衍射光學元件、超表面透鏡中的至少一者與具有三次相位結構的相位掩膜版組合形成的。

31、進一步的，所述第三掃描引擎為一維掃描引擎或二維掃描引擎。

32、更進一步的，所述第三掃描引擎包括壓電驅動器、偏轉方向相互垂直的一對壓電雙晶片或彎曲片、具有相互垂直的兩對表面電極的壓電晶體管或者基于微機電系統、線性或旋轉電機的掃描裝置。

33、在另一較為具體的實施案例中，所述掃描引擎包括第一掃描引擎和/或第二掃描引擎，所述第一掃描引擎與所述微型光針產生單元、所述中間圖像采集器傳動配合，所述第一掃描引擎用于驅使所述微型光針產生單元、所述中間圖像采集器同步進行二維掃描運動，所述第二掃描引擎與所述成像光路配合，所述第二掃描引擎用于驅使所述照明光束、所述背向信號光束進行二維掃描運動。

34、進一步的，所述第一掃描引擎、所述第二掃描引擎均為二維掃描引擎。

35、進一步的，所述第一掃描引擎包括偏轉方向相互垂直的一對壓電雙晶片或彎曲片、具有相互垂直的兩對表面電極的壓電晶體管或者基于微機電系統、線性或旋轉電機的掃描裝置。

36、進一步的，所述第二掃描引擎包括設置在所述成像光路內部的至少一組棱鏡對，所述棱鏡對包括兩個同軸設置的棱鏡，該兩個所述棱鏡能夠獨立地繞自身中軸線發生相對偏轉，而驅使所述照明光束、所述背向信號光束進行二維掃描運動。

37、進一步的，所述棱鏡為楔形棱鏡。

38、進一步的，所述棱鏡對所包含的兩個所述棱鏡的楔角相同或不同。

39、進一步的，所述棱鏡對所包含的兩個所述棱鏡的材質相同。

40、在一較為典型的實施案例中，所述微型光針產生單元包括反射鏡，所述反射鏡用于反射照明光束，反射后的照明光束的等效光光腰被鏡像到所述中間圖像采集器的斜切接收端面上。

41、在另一較為典型的實施案例中，所述微型光針產生單元包括光束整形組件和反射鏡，所述光束整形組件用于改變照明光束的形態參數，以將照明光束整形形成光針形態，所述形態參數包括數值孔徑、束腰直徑、瑞利長度中的至少一者，所述反射鏡用于反射經光束整形組件整形后的照明光束，以使反射后的照明光束的主光線與虛擬的光片形態的照明光束的傳播方向平行，反射后的照明光束的等效光腰被鏡像到所述中間圖像采集器的斜切接收端面上。

42、進一步的，光針形態的照明光束形態包括“長直形”或“彎曲狀”。

43、更進一步的，光針形態的照明光束包括高斯光束、貝塞爾光束或貝塞爾-高斯光束或艾里光束。

44、優選的，所述光束整形組件包括至少一個光束整形透鏡；優選的，所述光束整形透鏡包括雙凸透鏡、具有雙凹、平凸或雙凸球面或非球面面型的單透鏡、消色差透鏡、漸變折射率透鏡中的至少一者。

45、在一較為典型的實施案例中，光針形態的照明光束為貝塞爾-高斯光束，所述光束整形組件包括錐透鏡、具有軸棱錐全息相位的衍射光學元件、超表面透鏡中的至少一者，或者，所述光束整形組件是由準直透鏡、漸變折射率透鏡、漸變折射率光纖、微型球面或非球面透鏡中的至少一者與錐透鏡、具有軸棱錐全息相位的衍射光學元件、超表面透鏡中的至少一者組合形成的，或者，所述光束整形組件是一個以上的具有軸棱錐全息相位的衍射光學元件和/或超表面透鏡組合形成的。

46、在一較為典型的實施案例中，光針形態的照明光束為艾里光束，所述光束整形組件具有三次相位結構的相位掩膜版，或者，所述光束整形組件主要是由準直透鏡、漸變折射率透鏡、漸變折射率光纖、微型球面或非球面透鏡、衍射光學元件、超表面透鏡中的至少一者與具有三次相位結構的相位掩膜版組合形成的。

47、進一步的，所述成像光路包括依次設置的第一物鏡、中繼光學系統和第二物鏡，所述第一物鏡的前端面向成像樣本，所述第二物鏡的前端面向所述中間圖像采集器，所述第二掃描引擎設置在所述第一物鏡和所述第二物鏡之間，所述中繼光學系統用于將照明光束和所述第二掃描引擎的掃描運動中繼至位于所述第一物鏡的前端的成像樣本中以及將所述第一物鏡收集的背向信號光束傳送至所述第二物鏡，并在所述第二物鏡的焦點區重建得到所述中間圖像；

48、進一步的，所述成像光路與所述第二掃描引擎所包含的棱鏡同軸設置。

49、進一步的，所述第二掃描引擎與所述第一物鏡的后焦面共軛耦合。

50、進一步的，所述中繼光學系統包括4f系統。

51、進一步的，所述中間圖像采集器用于在光學層面上對中間圖像采樣，然后再傳輸至外置圖像傳感器上完成對該中間圖像的數字化記錄，或者，所述中間圖像采集器自身具備光電轉化功能，并可直接完成對中間圖像的像素化和數字化記錄。

52、進一步的，所述中間圖像采集器包括具有斜切接收端面的光纖傳像束，形成于所述成像光路的中間圖像能夠投射在所述光纖傳像束的斜切接收端面上，從而實現對所述中間圖像的接收和光學采樣。

53、進一步的，經所述光片角度調節元件調整后的所述照明光束/片的傳播方向與所述光纖傳像束的斜切接收端面平行，且所述照明光束的等效光腰落在所述光纖傳像束的接收端面上。

54、進一步的，所述照明光束的等效光腰與所述第二物鏡的焦點重合。

55、進一步的，所述第一掃描引擎設置在所述成像光路之外，所述微型光片產生單元或者所述微型光針產生單元與所述中間圖像采集器固定配合，所述微型光片產生單元或者所述微型光針產生單元與所述中間圖像采集器能夠被所述第一掃描引擎驅使而同步移動，所述中間圖像和所述中間圖像采集器同步移動且相對靜止。

56、進一步的，所述中間圖像與所述光纖傳像束的斜切接收端面始終保持相對靜止。

57、進一步的，所述中間圖像和所述中間圖像采集器均是靜止不動的。

58、本發明另一方面還提供了一種小型化三維體積成像顯微鏡系統，包括所述的小型化掃描顯微體積成像探頭。

59、進一步的，所述的小型化三維體積成像顯微鏡系統還包括：光源模塊，所述光源模塊用于提供照明光束。

60、進一步的，所述小型化三維體積成像顯微鏡系統還包括外置圖像傳感器，所述外置圖像傳感器用于接收所述中間圖像采集器的獲得的中間圖像。

61、進一步的，所述小型化三維體積成像顯微鏡系統還包括濾光元件，所述濾光元件設置在所述外置圖像傳感器與所述中間圖像采集器之間，所述濾光元件用于濾取特定波長范圍的光信號。

62、進一步的，所述濾光元件包括至少一個濾光片。

63、與現有技術相比，本發明的優點包括：

64、1)本發明提供的一種小型化掃描顯微體積成像探頭及成像系統，具有創新的照明光束(或光片)掃描引擎與掃描策略，擺脫了標準臺式斜光片掃描顯微鏡依賴反射式檢流計掃描振鏡或微機電系統(mems)掃描振鏡的設計慣例，避免了成像光路在振鏡處呈直角彎折的弊端，使得主物鏡、中繼透鏡組、第二物鏡等可以同軸放置，極大提升了前端鏡筒部分的緊湊化與纖細化程度。

65、2)本發明提供的一種小型化掃描顯微體積成像探頭及成像系統，具有創新的中間圖像采集器設計和對應的去掃描探測策略，使得體積龐大的相機可以與成像探頭相分離，在實現高速三維顯微體積成像的同時，保證了成像探頭的體積小巧與輕便靈活。

66、3)與寬場落照式內窺鏡相比，本發明提供的小型化顯微成像探頭具備深度層析(即光學切片能力)和三維體積成像能力，能夠清晰可視化表皮下組織的三維微觀結構。與基于背向散射光的光學相干斷層掃描(oct)成像模態相比，本發明提供的小型化三維顯微體積成像探頭可以基利用熒光信號成像，能夠提供分子靈敏度、亞細胞級別的空間分辨率和更加豐富的圖像對比度信息。

67、4)與基于共聚焦熒光、雙光子熒光或相干拉曼等依賴緊聚焦激發光的點掃描成像模態的內窺成像探頭相比，本發明提供的小型化體積成像探頭采用了光片照明和并行探測成像策略，能在無需機械移動成像探頭或成像樣本的前提下實施三維顯微成像，使得三維體積率有數量級的提升，即使活體組織與探頭之間存在無規則的軸向相對運動，本發明提供的成像探頭所采集的相鄰兩組體數據塊之間仍有足夠的三維重疊，因此從所得的高速“三維體積數據流”中可以直觀準確地估計相鄰體數據塊之間的三維錯位，進而經配準融合生成覆蓋若干毫米范圍的全景三維圖像，為臨床應用提供更加豐富、準確的在體原位病理學反饋。

68、5)與臺式共焦斜光片掃描顯微鏡相比，本發明在保持其高速三維體積成像優勢的同時，通過創新的照明光束(或光片)掃描引擎與掃描策略，規避了前者成像光路在振鏡處呈直角彎折的弊端，并通過創新的中間圖像和去掃描探測策略，使得體積龐大的相機可以與成像探頭相分離，極大提升了成像探頭的緊湊化與纖細化程度，從而在小型化、細長硬管形顯微(或內窺顯微)成像探頭上實現了“無需切片、勝似切片”的高時空分辨、原位在體病理學成像。