本發明涉及生物材料，更具體地，涉及一種細菌活性保護涂層及其制備方法與應用。

背景技術：

1、以益生菌為代表的菌體在生產以及使用過程中均面臨菌體容易失活的挑戰。從菌種的冷凍保藏到加工、貯藏，再到體內消化等多個環節，溫度、濕度、氧氣及胃酸、膽鹽均影響益生菌活性與存活。如多數益生菌屬于厭氧菌，在生產運輸保存過程中與氧氣接觸會導致益生菌無法存活，喪失細菌活性。此外，在口服益生菌時，胃酸中h+會引起益生菌的表面膜電位變化，使益生菌表面通透性改變，從而導致其死亡。益生菌在胃部時，胃酸會殺滅70％以上的益生菌，最終進入人體腸道的益生菌數量甚至難以達到106cfu/ml(cfu/g)的有效標準，極大地限制了益生菌的有效口服藥效。益生菌與腸黏液相互作用弱，加上消化道蠕動和消化液沖刷，益生菌難以在腸道有效定植，難以發揮益生作用。因此，保持益生菌體外穩定性和體內腸道存活率是亟待研究解決的重要問題也是益生菌生產應用中所面臨的巨大挑戰。

2、現有的細菌保護技術表明遞送載體能提升益生菌的細菌活性與腸道黏附能力。目前用于實現益生菌腸道靶向輸送的口服遞送系統通常包括微膠囊、水凝膠、油凝膠、納米涂層、乳液、納米纖維、孢子、生物膜等。

3、微膠囊是由食品大分子通過噴霧干燥法制備的具有核殼結構的保護載體，可以將益生菌和外界環境隔絕，實現益生菌的控制釋放。cn115969039a提供了一種基于w/g/w結構的益生菌微膠囊的制備方法，但是所使用的冷凍干燥設備昂貴，且處理量較小、過程歷時久、耗費大量能源、制備周期長，也易造成一定活菌損耗。cn115624180a提供了一種包含骨橋蛋白的益生菌微膠囊及其制備方法，該方法條件及材料來源限制嚴格，不適合大批量制備，尤其是海藻酸鈉等溶解度低，且容易造成高粘度，限制了微膠囊的制備。

4、水凝膠是由親水性大分子通過物理或化學交聯而形成的具有吸水膨脹性的三維網絡結構，益生菌可以封裝在水凝膠微球的內部或接種在微球表面。cn117357468a提供了一種可長期儲存的益生菌凝膠制劑及其使用方法和應用，但該專利的使用場景有局限性，制備的凝膠制劑只能應用在皮膚黏膜，不能廣泛應用。cn107714672a提供了一種婦用陰道活性益生菌凝膠包囊及其制備方法，雖然使用的明膠是一種較為簡單和廉價的原料，但純明膠在干燥后質地脆、成型能力弱、延展性低、潮濕環境中易受細菌侵蝕而變質。

5、油凝膠是液態油通過添加凝膠劑，自組裝為網絡結構或液態油結晶，進而形成包含非極性液相的黏彈性三維網絡結構材料。油凝膠具有疏水性和乳化性，相較于水凝膠，其物理屏障可以更好地隔離水分，提高益生菌存活率。而乳液形式的遞送方法雖然操作簡便，但穩定性較差，在長時間的運輸過程中容易發生分層、沉淀等現象，導致益生菌的活性降低。此外，乳液遞送還面臨著運輸成本高、儲存不方便等挑戰，尤其是在高溫或冷凍環境下，益生菌的存活率會大打折扣。

6、此外，納米涂層可以通過氫鍵、π-π堆積、邁克爾加成反應和席夫堿反應形成聚多巴胺納米涂層，封裝單個活細胞，顯著提高益生菌的生物利用率(未封裝微生物的30倍以上)。如上海交通大學醫學院分子醫學研究院劉盡堯課題組通過在多巴胺聚合過程中加入少量殼聚糖，可使益生菌表面附著上聚多巴胺和殼聚糖共沉積外衣，保護益生菌抵抗胃液膽汁的侵蝕，改善腸炎治療的效果。然而，上述方法并不能實現保護和靶向輸送益生菌到特定的生理環境。

技術實現思路

1、本發明為克服上述現有技術所述的不能實現保護和靶向輸送益生菌到特定生理環境(腸胃道)的缺陷，提供一種細菌活性保護涂層；

2、本發明的另一目的在于提供一種細菌活性保護涂層的制備方法；

3、本發明的另一目的在于提供一種細菌活性保護涂層的應用；

4、本發明的另一目的在于提供一種細菌的保護方法。

5、為解決上述技術問題，本發明的技術方案如下：

6、一種細菌活性保護涂層，包括以下組分制備得到：甲基丙烯酸類共聚物、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺類化合物和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)制備得到。

7、優選地，還包括緩沖液。

8、優選地，甲基丙烯酸類共聚物、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺類化合物和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)的質量比為1:(8～12):(4～6)。

9、優選地，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺類化合物包括1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(edc)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽。

10、優選地，所述甲基丙烯酸類共聚物為甲基丙烯酸與甲基丙烯酸甲酯或丙烯酸乙酯的共聚物。

11、優選地，所述甲基丙烯酸與甲基丙烯酸甲酯或丙烯酸乙酯的共聚物在ph>5.5時發生溶解。

12、優選地，甲基丙烯酸與甲基丙烯酸甲酯或丙烯酸乙酯的物質的量比為1:1。

13、優選地，所述甲基丙烯酸與丙烯酸乙酯的共聚物包括eudragit?l100-55，甲基丙烯酸與甲基丙烯酸甲酯的共聚物包括eudragit?l100。

14、在本發明所使用的eudragit?l100-55為可再分散性粉末，易于加工和應用。eudragit?l100-55在ph<5.0時不發生溶解，當ph>5.5時逐漸發生溶解。eudragit?l100-55在ph>6的環境下溶解。因此，兩者均適用于控制藥物在胃液中釋放，并確保藥物在腸道中定點釋放。

15、優選地，所述甲基丙烯酸與丙烯酸乙酯的共聚物為eudragit?l100-55。

16、甲基丙烯酸與丙烯酸乙酯的共聚物在酸性環境下，甲基丙烯酸部分保持非電離狀態，導致共聚物的疏水性增加，溶解性降低；甲基丙烯酸乙酯通過調整共聚物的親疏水平衡，可以改變ph響應的敏感性或范圍。

17、一種所述細菌活性保護涂層，包括以下步驟：

18、s1、將甲基丙烯酸類共聚物分散于緩沖液中；

19、s2、加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺類化合物和n-羥基琥珀酰亞胺，混合均勻，反應完成后得到所述細菌活性保護涂層。

20、進一步地，將甲基丙烯酸類共聚物溶解于緩沖液后，緩沖液的ph為4.0～6.5。

21、優選地，將ph調整為4.5～6.0。

22、優選地，將ph調整為5.0～6.0。

23、優選地，所述緩沖液包括嗎啉異磺酸(mes)。

24、優選地，所述嗎啉異磺酸的濃度為0.1mol/l。

25、優選地，s2中在25～40℃下反應1～5小時。

26、優選地，s2中在37℃下反應2小時。

27、在交聯過程中，緩沖液起到了至關重要的作用。緩沖液的主要功能是調節溶液的ph值，在ph值4.5～7.2時，有助于edc和nhs的活性達到最佳狀態。edc與nhs是羧基和氨基成酰胺反應的縮合劑，它們能夠促使羧基和氨基之間形成穩定的酰胺鍵。緩沖液的使用確保了edc與nhs交聯反應在一個穩定且適宜的ph環境中進行，從而提高了交聯反應的效率。

28、edc和nhs能夠與eudragit?l100-55上的羧基官能團發生反應，從而實現兩者的有效交聯。首先edc作為偶聯劑，激活eudragit?l100-55上的羧基，而nhs則能夠穩定這些被激活的基團與eudragit?l100-55反應形成半穩定中間體，防止激活后的eudragit?l100-55在溶液中發生水解。

29、一種所述細菌活性保護涂層的應用，用于制備具有ph響應性的、可保護活性成分靶向釋放的涂層或載體。

30、優選地，所述涂層或載體應用的領域包括農業、食品、生物醫療。

31、進一步地，所述活性成分包括微生物、生物大分子、化學藥物。

32、優選地，所述微生物包括益生菌、環境功能菌、工業菌株、病原微生物載體；所述生物大分子包括蛋白質(酶、抗體)、核酸(基因、mrna)、多糖(透明質酸)；所述化學藥物：包括小分子藥物、靶向藥物、控釋藥物、化學農藥和營養補充劑。

33、進一步地，用于制備保護益生菌靶向輸送到腸胃道及其他ph變化明顯部位的涂層或載體。

34、本專利的涂料具有潛在的廣泛應用性，不僅限于微生物領域。實際上，任何需要在特定環境條件下保護和釋放活性成分的應用，都可能受益于這種ph響應性材料與共價鍵連接的技術。例如，在藥物遞送領域，類似的技術可以用于保護和靶向輸送藥物到特定的生理環境，這對于提高藥物的生物利用度、減少副作用以及實現精準醫療具有重要意義。

35、此外，在農業、食品科學、生物技術等其他領域，該技術同樣具有潛在的應用價值。例如，在植物保護領域，可以利用這種技術來保護農藥活性成分，使其在特定的環境條件下釋放，以提高防治效果并減少對環境的污染。在食品科學領域，該技術可以用于保護和增強食品中的功能性成分，如抗氧化劑、營養素等。

36、一種細菌的保護方法，使用所述細菌活性保護涂層，將所述細菌活性保護涂層與細菌混合，反應完成后細菌表面覆有致密保護層。

37、優選地，細菌的菌液準備包括以下步驟：通過離心操作，分離出細菌，并用磷酸鹽緩沖液洗滌，洗滌后的細菌用磷酸鹽緩沖液重新懸浮，形成均勻的菌液。洗滌目的為去除培養基殘留，保證不含有外來羧基和氨基，以避免對交聯反應產生干擾。

38、優選地，混合后置于35～40℃下反應20～40分鐘，使甲基丙烯酸類共聚物與細菌細胞壁充分交聯。反應期間可以通過上下顛倒的方式攪拌溶液，確保反應物之間的充分接觸和均勻混合。這樣的反應條件能夠最大程度地促進交聯反應的進行，提高交聯效率。

39、進一步地，細菌活性保護涂層與細菌混合后，所述細菌活性保護涂層中甲基丙烯酸類共聚物的濃度為0.1～5mg/ml。

40、進一步地，細菌活性保護涂層與細菌以1:1～2的體積比混合。

41、細菌活性保護涂層與細菌在該體積比下混合，既實現甲基丙烯酸類共聚物對細菌細胞壁的有效鏈接，同時避免對細菌活性造成不利影響。

42、本發明將甲基丙烯酸與丙烯酸乙酯的共聚物進行活化，得到細菌活性保護涂層，并將涂料與益生菌細胞壁進行化學鍵的共價連接制備成保護涂層。當益生菌通過口服進入胃部的強酸胃液(ph為1.0～4.0)環境時，涂層可以有效保護益生菌不被強酸環境所殺滅，但益生菌通過胃部到達腸道時，腸道ph為6.8～7.0之間的弱堿性環境可以將益生菌表面的涂層進行溶解，從而釋放出益生菌發揮功效。

43、本發明采用了edc與nhs交聯方法，成功地將ph響應性的商業化試劑eudragitl100-55與益生菌活細胞壁進行共價鍵連接。這一創新技術在益生菌表面形成了一層極為致密的保護層，確保益生菌在穿越胃酸環境時得到良好的保護，從而避免被胃酸破壞生物活性。本發明的涂料不僅有效地保護了益生菌免受胃酸等有害因素的侵害，還實現了益生菌在腸道的靶向釋放。這一技術突破大大提高了益生菌在人體內的存活率和功能性，為益生菌在醫療健康領域的應用提供了強有力的支持。

44、利用本發明的涂料對益生菌進行包覆，不僅可以有效地保護益生菌免受外界環境的影響，還能夠在冷凍干燥過程中保持細胞的活性。這種涂層技術不僅簡化了制備工藝，還降低了生產成本，同時提高了益生菌的穩定性和儲存便利性。具體而言，單細胞涂層技術可以通過控制涂層的厚度和材料選擇，實現對益生菌的精確保護。涂層材料通常具有良好的生物相容性和穩定性，能夠有效地防止益生菌與外界環境的直接接觸，從而避免其在加工、貯藏和運輸過程中的活性損失。此外，涂層后的益生菌可以通過冷凍干燥的方式進行長期儲存，這不僅方便了運輸和儲存，還能夠在需要時快速恢復益生菌的活性，保證其在使用過程中發揮最佳效果。

45、與現有技術相比，本發明技術方案的有益效果是：

46、1、提高益生菌的胃酸耐受性與存活率。使用eudragit?l100-55對細菌進行共價連接保護，有效地阻擋胃酸對細菌的破壞，確保其存活穿越胃部的強酸環境，顯著提高了益生菌的胃酸耐受性。即使在胃酸環境中處理1小時后，菌落數量減少的幅度明顯小于對照組，表現出較強的耐酸能力。

47、2、實現腸道ph響應性靶向釋放。基于甲基丙烯酸與甲基丙烯酸乙酯共聚物的ph響應性，涂層在胃酸環境中完整無損，而在模擬腸道環境(ph?6.8～7.0)下涂層完全溶解，釋放益生菌。本發明涂料的使用確保了細菌在穿越胃酸環境后能夠靶向釋放到腸道，達到精準遞送的效果，實現細菌在胃部保護、腸道釋放的雙重功能。

48、3、生物相容性良好，無毒副作用。使用本發明涂料處理的細菌生長曲線與未使用的對照組基本一致，且培養過程中的生長速率相近，無統計學顯著性差異。說明本發明所使用的涂料對細菌生物相容性良好，不會抑制其生長或影響其活性。這種生物相容性確保了涂層在保護益生菌的同時，不會對其生理功能造成任何不利影響。

49、4、納米涂層均勻覆蓋益生菌表面，形成穩定保護層。采用edc和nhs交聯活化方法，使涂料與細菌細胞壁上的氨基共價連接，形成穩定且致密的保護層。透射電子顯微鏡下觀察到在益細菌表面形成了均勻的納米保護層，未發現細菌細胞膜損傷或內含物泄漏現象。保護層厚度均勻，圖像對比度增強，進一步證明了涂層的完整性和穩定性。

50、5、適用范圍廣，具備工業化應用潛力。通過調控eudragit?l100-55的濃度和應用時的添加比例，可以根據不同應用需求實現涂層厚度和保護效果的靈活調整。本發明不僅適用于益生菌的保護和靶向輸送，還可應用于其他活性成分的保護與釋放。另外，良好的材料可加工性和環境適應性，為其在食品、農業和生物醫療等多個領域的工業化推廣奠定了基礎。