本發明涉及一種雙硒脂質納米粒，還涉及上述納米粒的制備方法和應用。

背景技術：

1、惡性腫瘤作為目前全球范圍內的主要死亡原因之一，已成為嚴重危害人類生命健康的重大疾病。在抗腫瘤治療的不斷探索與演進中，基因療法作為一種新興且充滿潛力的治療手段，正逐步展現出相對于傳統抗腫瘤手段的獨特優勢。基因療法的核心在于直接針對腫瘤發生發展的遺傳學基礎進行干預，利用核糖核酸(rna)或脫氧核糖核酸(dna)作為模板，實現治療性目的蛋白的持續產生，從源頭上阻斷腫瘤的生長與擴散，不僅提高了治療的精準度，還能夠在分子層面實現個體化治療，顯著提升了治療的有效性與安全性，為癌癥治療開辟了新的途徑。其中，信使核糖核酸(mrna)作為單鏈rna，攜帶蛋白質編碼信息，相較于dna具有幾大優勢：首先，mrna無需進入細胞核，直接在細胞質中啟動蛋白質翻譯，這一過程相較于dna先進入細胞核再轉錄為mrna的效率更高；其次，mrna不會整合到宿主基因組中，避免了基因組污染的風險；最后，mrna可通過體外轉錄(ivt)技術合成，這一過程成本較低且快速。然而，mrna作為一種較大的、帶負電荷且不穩定的分子，在體內極易被核酸酶降解。傳統的納米顆粒難以有效裝載并保護mrna，因此，開發高性能的載體系統，以精準、穩定地將mrna輸送至目標部位，成為當前研究的迫切需求。

2、遞送mrna的載體分為兩大類：病毒載體(主要包括慢病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒等)，非病毒載體(主要包括脂質體復合物、陽離子多聚物、殼聚糖聚合物等)。在臨床基因治療中，病毒載體存在潛在安全性問題，且病毒載體容量有限，這些缺點促進了非病毒載體系統的發展。非病毒載體具有成本低、制備簡單、便于大規模生產、安全性高、外源基因長度不受限制等優點。

3、其中，脂質納米粒(lnp)是臨床應用的理想核酸遞送載體，因為它們具有良好的安全性、大規模生產能力以及有效遞送mrna的多功能性。然而，lnp-mrna復合物在內體中的逃逸效率低下，僅約1％至4％的mrna能夠成功轉移至細胞質，這一局限顯著阻礙了足量蛋白質的產生。此外，lnp通常需采用高n/p比來確保mrna的完全包裹，從而賦予其高度的穩定性。然而，這種高度穩定性與理想的釋放性能之間存在著固有的矛盾——高度的體內穩定性往往意味著脂質納米粒攜帶的藥物難以在細胞內實現充分釋放，進而削弱了整體的遞送效率。鑒于此，為了提升基因療法在抗腫瘤治療中的效果，急需研發具備出色的內體逃逸能力以及時空可控的降解特性的新型脂質納米粒。

技術實現思路

1、發明目的：本發明的目的是提供一種兼具主動靶向和強效轉染能力的雙硒脂質納米粒，還提供上述雙硒脂質納米粒的制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。

2、技術方案：本發明公開了一種雙硒脂質納米粒，所述納米粒由陽離子脂質、中性磷脂、膽固醇、功能化peg脂質組成骨架，正電荷的陽離子脂質與負電荷的核酸分子通過靜電作用在脂質層內部形成了多層核心結構，并搭載編碼治療蛋白的mrna和tlr激動劑組成的球形囊泡。

3、其中，所述陽離子脂質為n-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨(dotma)，中性磷脂為1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(dope)，功能化peg脂質為dmg-peg2000-biotin(bpd)和dspe-se-se-peg2000-cf3(fpsed)，搭載編碼治療蛋白的mrna為il-15mrna，tlr激動劑為雷西莫德(r848)。

4、上述雙硒脂質納米粒的制備方法，包括以下步驟：

5、(1)將4,4,4-三氟丁酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edci)、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)、三乙胺溶于二氯甲烷(dcm)中，在冰浴下攪拌，再將dspe-se-se-peg2000-nh2加入到上述體系中，室溫攪拌，旋蒸除去二氯甲烷，透析，凍干即得dspe-se-se-peg2000-cf3(fpsed)；

6、(2)將n-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨(dotma)、膽固醇(chol)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(dope)、dmg-peg2000-biotin(bfd)、dspe-se-se-peg2000-cf3(fpsed)、tlr激動劑溶于乙醇中形成乙醇相，將編碼治療蛋白的mrna溶于水相，快速攪拌并將乙醇相滴入水相，透析，過濾，即得雙硒脂質納米粒。

7、其中，步驟(1)中，4,4,4-三氟丁酸、edci、nhs、三乙胺、dspe-peg2000-nh2的物質的量之比為1-2：1-2：1-2：2-4：1。

8、其中，步驟(1)中，攪拌速度為450～550rpm，優選為500rpm；所述冰浴，攪拌時間為30-60分鐘；所述室溫攪拌，時間為12-24小時；旋蒸的條件為90rpm，37℃，10分鐘；所述透析，介質為超純水，時間為1-3天，透析袋分子量為500da。

9、其中，步驟(2)中，n-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨(dotma)、膽固醇(chol)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(dope)、dmg-peg2000-biotin(bfd)、dspe-se-se-peg2000-cf3(fpsed)的物質的量之比為50：36-40：10：1-3：1-3。

10、其中，步驟(2)中，雷西莫德(r848)與總脂質的質量比為1-2：10，il-15mrna與陽離子脂質的質量比為1：6-8；所述總脂質為陽離子脂質、中性磷脂、膽固醇和功能化peg脂質；所述乙醇相與水相的體積比為1：3。

11、其中，步驟(2)中，所述水相為檸檬酸鹽緩沖溶液，優選為ph?4.0、10mm的檸檬酸鹽緩沖溶液。

12、其中，步驟(2)中，所述攪拌速度為900-1100rpm，攪拌時間為25～35分鐘，優選為30分鐘；所述透析，介質為pbs緩沖液，優選為ph?7.4的pbs緩沖液，透析時間為2小時，透析袋分子量為3500da。

13、上述雙硒脂質納米粒還可以應用在制備抗腫瘤藥物中。

14、發明原理：本發明的兼具主動靶向和強效轉染能力的雙硒脂質納米粒，主要成分包括：陽離子脂質，中性磷脂，膽固醇，功能化peg脂質；同時搭載編碼治療蛋白的mrna和tlr激動劑，通過乙醇注入法合成。該納米粒具有較強的靶向作用和細胞轉染能力；其中，功能化peg脂質為生物素修飾peg脂質(dmg-peg2000-biotin，bpd)和三氟基團修飾的peg脂質(dspe-se-se-peg2000-cf3，fpsed)，生物素和三氟基團為功能化部分。

15、具體為，一方面利用生物素修飾的peg脂質，使得脂質納米粒主動靶向到腫瘤微環境中并被腫瘤細胞攝取。另一方面，在腫瘤細胞內，利用三氟基團修飾的peg脂質實現快速的“內含體-溶酶體”逃逸，同時該納米粒呈谷胱甘肽/過氧化氫(2)雙模式降解，實現被包載藥物的迅速且有效釋放。降解示意圖如圖3所示，納米粒被攝取進腫瘤細胞后，細胞內高濃度的谷胱甘肽與過氧化氫環境促使雙硒鍵發生斷裂，這一過程加速了il-15mrna與r848分子的迅速釋放。il-15mrna在腫瘤細胞質迅速翻譯并源源不斷產生il-15蛋白，激活先天免疫和適應性免疫。r848作為小分子被動排出腫瘤細胞重新返回腫瘤微環境中，與m2樣tam表面的tlr7/8結合，促使m2?tam復極化為m1表型，解除癌細胞對il-15抵抗的同時重塑腫瘤微環境。這些效應序貫起效，互相協同，有效抑制腫瘤生長。本發明提供的藥物遞送系統合成方法簡單，基因轉染效率高，具有良好的生物安全性，在生理條件下穩定性高，在腫瘤組織中，材料表面的三氟甲基促進內含體-溶酶體逃逸，另外該納米材料在gsh和h2o2雙響應刺激下降解并迅速釋放藥物，在保護mrna活性的同時提高了基因轉染效率，在抗腫瘤研究和臨床應用上具潛在價值。

16、有益效果：與現有技術相比，本發明具有以下顯著優點：(1)本發明的雙硒脂質納米粒，能夠在gsh和h2o2雙響應刺激下降解并迅速釋放藥物，tlr激動劑的有效釋放率高于80％，mrna轉染效率高達90％，保護mrna活性的同時提高基因轉染效率，且穩定性高，具有較好的生物安全性能夠在生物體內可完全降解并能夠經正常代謝途徑排泄；(2)合成方法工藝簡單、成本低廉、需求條件溫和、產品穩定等特點，適合工業化生產；(3)作為穩定性欠佳的藥物的載體，具有普適性及推廣性，具有良好的轉化價值，并且可根據不同需求協同多種治療手段，實現腫瘤協同治療從而達到最佳的腫瘤治療效果。