一種色素三肽制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種色素三肽制備方法，以藻藍蛋白α-亞基或藻紅藍蛋白α-亞基為原料，通過對藻藍蛋白α-亞基或藻紅藍蛋白α-亞基的降解、水解產物的粗提純、濃縮、高效液相色譜法制備色素三肽、干燥，得到高純度的色素三肽，本發明填補了利用藻膽蛋白的降解生產色素肽的技術空白。利用本發明制備的色素三肽，作為天然色素可廣泛應用于食品、化妝品、染料、醫療、保健等領域，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種色素三肽制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種色素三肽制備方法，屬于食用色素制備領域。
【背景技術】
[0002]藻膽蛋白是大量存在于紅藻(Rhodophyta)、藍綠藻(Cyanophyta)和隱藻(Cryptophyta)中的捕光色素蛋白，一般被稱之為藻膽色素蛋白。藻膽蛋白除了作為細胞中的儲存蛋白，以使藻類在氮源缺乏的季節得以生存外，還具有在光合作用中作為捕光色素系統進行吸收和傳遞能量的功能，是紅藻、藍藻和隱藻中除葉綠素a(Chla)外的另一類光合色素。藻膽蛋白把捕獲的光能高效地傳遞給葉綠素，從而使藍藻的光合作用得以發生。
[0003]藻膽蛋白由藻膽色素與相應的脫輔基蛋白中保守半胱氨酸殘基上的巰基以硫醚鍵共價結合而成。藻膽蛋白的光吸收區位于藍綠光區，可以利用高等植物不能利用的光能，根據藻膽蛋白中色素捕獲光能的不同，藻膽蛋白可分為:較高能量的藻紅蛋白或藻紅藍蛋白(PE或PEC)、中等能量的藻藍蛋白(PC)、較低能量的變藻藍蛋白(APC)，其中，位于核心的變藻藍蛋白被認為是最穩定的分子。
[0004]藻膽色素是具有開鏈四吡咯結構的化合物(四個相互連接的吡咯環)，藻膽色素上沒有金屬離子，通過硫醚鍵共價連接于脫輔基蛋白的特定半胱氨酸殘基上。在藍藻中，共有四種不同的藻膽色素:藻藍膽素(PCB)，藻紅膽素(PEB)，藻尿膽素(PUB)和藻紫膽素(PVB)。
[0005]目前關于藻膽蛋白提取、提純的方法非常多，但關于藻膽蛋白的降解生產色素肽的制備方法還未見報道。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于填補現有技術的空白，提供一種色素三肽的制備方法。
[0007]本發明的目的通過下述技術方案實現:
[0008](I)降解藻藍蛋白α-亞基或藻紅藍蛋白α-亞基:將藻藍蛋白α -亞基或藻紅藍蛋白α-亞基，溶解于磷酸鉀緩沖液中，用胰蛋白酶水解，得水解產物；
[0009](2)粗提純:將步驟⑴得到的水解產 物加樣于用稀鹽酸平衡的凝膠層析柱，先用鹽酸溶液洗脫無色肽和鹽，最后用乙酸溶液回收色素肽；
[0010](3)濃縮:將步驟(2)回收的色素肽經層析柱濃縮，用甲醇洗脫，收集洗脫液，去除甲醇，得到濃縮色素肽；
[0011](4)高效液相色譜法制備色素三肽:將步驟(3)得到的濃縮色素肽通過高效液相色譜收集得到色素三肽樣品；
[0012](5)干燥:將步驟⑷收集得到的色素三肽樣品干燥，得到色素三肽。
[0013]上述步驟(I)中所述的藻藍蛋白α -亞基或藻紅藍蛋白α -亞基溶解于磷酸鉀緩沖液中的濃度優選為10D，所述胰蛋白酶濃度優選為lmg/mL。
[0014]上述步驟⑴中所述的磷酸鉀緩沖液優選為濃度為lOOmmol/L、pH值為7.2的磷酸鉀緩沖液。
[0015]上述步驟(I)中所述的用胰蛋白酶水解的溫度優選為37°C，水解時間優選為3小時。
[0016]上述步驟(2)中所述的用于洗脫無色肽和鹽的鹽酸溶液pH值優選為2.5，所述的乙酸溶液優選為體積百分比濃度為30%的乙酸溶液。
[0017]上述步驟(3)中所述的去除甲醇的方法優選為用惰性氣體吹去甲醇，或者用真空濃縮洗脫液的方法去除甲醇。
[0018]當上述步驟(I)中降解藻藍蛋白α-亞基時，上述步驟(4)中所述的高效液相色譜法的條件優選為:流速為1.0mL/min ;紫外檢測器的檢測波長為560nm ;流動相包括溶液A和溶液B，所述溶液A為體積百分比濃度是0.1%、pH值是2.0的甲酸，所述溶液B為含有體積百分比濃度是0.1%甲酸的乙腈；設定程序為時間分別為O分鐘、2分鐘、32分鐘、35分鐘、55分鐘，溶液A和溶液B的體積比相應地分別為80: 20,80: 20,60: 40,80: 20、80: 20，收集保留時間為16.4分鐘的樣品。
[0019]當上述步驟(I)中降解藻紅藍蛋白α-亞基時，上述步驟(4)中所述的高效液相色譜法的條件優選為:流速為1.0mL/min ;紫外檢測器的檢測波長為560nm ;流動相包括溶液A和溶液B，所述溶液A為體積百分比濃度是0.1%、ρΗ值是2.0的甲酸，所述溶液B為含有體積百分比濃度 是0.1%甲酸的乙腈；設定程序為時間分別為O分鐘、2分鐘、32分鐘、35分鐘、55分鐘，溶液A和溶液B的體積比相應地分別為80: 20,80: 20,60: 40,80: 20、80: 20，收集保留時間為13.3分鐘的樣品。
[0020]上述步驟(5)中所述的干燥優選為將所述色素三肽樣品在45°C下真空干燥。
[0021]運用本發明方法，可以得到高純度的色素三肽，填補了利用藻膽蛋白的降解生產色素肽的技術空白。運用本發明方法制備的色素三肽，既可以作為天然色素用于食品、化妝品、染料等工業上，也可制成熒光試劑，用于臨床醫學診斷和免疫化學及生物工程等研究領域中。另外，還可以制成食品和藥品用于醫療保健上，應用范圍廣闊，具有很高的開發、利用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為實施例1色素肽的分離高效液相色譜圖。
[0023]圖2為實施例1色素肽的原位吸收圖譜。
[0024]圖3為實施例1提純的色素肽質譜圖。
[0025]圖4為實施例2色素肽的原位吸收圖譜。
[0026]圖5為實施例2色素肽的分離高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0027]現結合實施例詳細說明本發明的技術方案。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0028]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0029]實施例1[0030](I)、藻藍蛋白α -亞基降解
[0031]將提純的藻藍蛋白α -亞基13mg，溶解于IOmL濃度為100mmol/L、pH值為7.2的磷酸鉀緩沖液中，加入IOmg胰蛋白酶(此溶液中藻藍蛋白α-亞基終濃度約為10D，胰蛋白酶濃度為lmg/mL)，37°C水解3h，得水解產物。
[0032](2)、粗提純
[0033]水解完成后，將步驟(I)中得到的水解產物加樣于用稀鹽酸平衡的凝膠層析柱，先用pH=2.5的鹽酸溶液洗脫無色肽和鹽,最后用體積百分比濃度為30%乙酸回收色素肽。
[0034](3)、濃縮
[0035]將步驟(2)回收的色素肽經層析柱濃縮，用甲醇洗脫，收集到樣品管，然后用氬氣吹掉甲醇，得到濃縮的色素肽。
[0036](4)、高效液相色譜法制備色素三肽
[0037]將步驟(3)得到的濃縮色素肽用高效液相色譜法進行制備，流速為1.0mL/min ;紫外檢測器檢測波長為560nm ;流動相包括溶液A和溶液B，所述溶液A為體積百分比濃度是
0.1%、pH值是2.0的甲酸，所述溶液B為含有體積百分比濃度是0.1%甲酸的乙腈；設定程序為
[0038]
【權利要求】
1.一種色素三肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)降解藻藍蛋白α-亞基或藻紅藍蛋白α-亞基:將藻藍蛋白α-亞基或藻紅藍蛋白α-亞基，溶解于磷酸鉀緩沖液中，用胰蛋白酶水解，得水解產物； (2)粗提純:將步驟(I)得到的水解產物加樣于用稀鹽酸平衡的凝膠層析柱，先用鹽酸溶液洗脫無色肽和鹽，最后用乙酸溶液回收色素肽； (3)濃縮:將步驟(2)回收的色素肽經層析柱濃縮，用甲醇洗脫，收集洗脫液，去除甲醇，得到濃縮色素肽； (4)高效液相色譜法制備色素三肽:將步驟(3)得到的濃縮色素肽通過高效液相色譜收集得到色素三肽樣品； (5)干燥:將步驟(4)收集得到的色素三肽樣品干燥，得到色素三肽。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的藻藍蛋白α-亞基或藻紅藍蛋白α-亞基溶解于磷酸鉀緩沖液中的濃度是I 0D，所述胰蛋白酶濃度為I mg/mLo
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的磷酸鉀緩沖液濃度為 100 mmol/L, pH 值為 7.2。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的用胰蛋白酶水解的溫度為37°C，水解時間為3小時。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述的用于洗脫無色肽和鹽的鹽酸溶液pH值為 2.5，所述的乙酸溶液是體積百分比濃度為30%的乙酸溶液。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述的去除甲醇的方法為用惰性氣體吹去甲醇，或者用真空濃縮洗脫液的方法去除甲醇。
7.根據權利要求1?6任一項所述的制備方法，其特征在于:步驟(I)中降解藻藍蛋白α-亞基，步驟(4)中所述的高效液相色譜法的條件是:流速為1.0 mL /min;紫外檢測器的檢測波長為560nm ;流動相包括溶液A和溶液B，所述溶液A為體積百分比濃度是0.1%、PH值是2.0的甲酸，所述溶液B為含有體積百分比濃度是0.1%甲酸的乙腈；設定程序為時間分別為O分鐘、2分鐘、32分鐘、35分鐘、55分鐘，溶液A和溶液B的體積比相應地分別為80:20、80:20、60:40、80:20、80:20，收集保留時間為16.4分鐘的樣品。
8.根據權利要求1?6任一項所述的制備方法，其特征在于:步驟(I)中降解藻紅藍蛋白α-亞基，步驟(4)中所述的高效液相色譜法的條件是:流速為1.0 mL /min;紫外檢測器的檢測波長為560nm ;流動相包括溶液A和溶液B，所述溶液A為體積百分比濃度是0.1%、PH值是2.0的甲酸，所述溶液B為含有體積百分比濃度是0.1%甲酸的乙腈；設定程序為時間分別為O分鐘、2分鐘、32分鐘、35分鐘、55分鐘，溶液A和溶液B的體積比相應地分別為80:20、80:20、60:40、80:20、80:20，收集保留時間為13.3分鐘的樣品。
9.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(5)中所述的干燥為將所述色素三肽樣品在45°C下真空干燥。
【文檔編號】C07K1/16GK103435681SQ201310388840
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月30日 優先權日:2013年8月30日
【發明者】涂俊銘 申請人:湖北師范學院