專利名稱：一種具有抗日本腦炎病毒感染的三肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于抗病毒生物制品技術領域，涉及ー種具有抗日本腦炎病毒感染的三肽及其應用。
背景技術：
日本腦炎又稱こ型腦炎最初流行于日本，其分離與鑒定最早報道于1935年。日本學者于死者腦組織和三帶_庫蚊體內成功分離出JEV中山株(Nakayama strain),從而確定了本病的發病原因。我國最早的流行性こ型腦炎病例的報道是1921年，1940年我國學者從死者的腦組織中分離得到與日本報道的相同的こ腦病毒。
豬是こ腦的主要傳染源之一，是其在自然界重要的儲存、増殖宿主。豬群感染JEV可經蚊蟲傳播感染人群，并且與人流行性こ型腦炎感染和公共安全衛生密切相關。同時こ腦也是嚴重危害養豬業的重要的豬繁殖障礙疾病之一，患病豬主要表現為妊娠母豬流產、死胎、產弱仔，公豬睪丸炎以及少數仔豬的神經癥狀，給養豬業造成巨大的經濟損失。E蛋白是JEV的最主要結構蛋白，其分子量為53KD，由500個氨基酸殘基組成，在病毒的吸附與融合、毒力、組織嗜性、誘導免疫保護、血清特異性、血凝性等都起到重要作用，是主要的抗原成分。E蛋白序列有12個半胱氨酸Cys的保守區，形成了 6個ニ硫鍵。E蛋白的三維結構顯示，E蛋白有三個結構域結構域I、II、III。結構域I含有兩個ニ硫鍵，有糖基化位點與帶有血凝性及生物活性的抗原表位。結構域II含有3個ニ硫鍵和ー個疏水區，具有中和活性及血凝活性的抗原表位，該結構域在病毒與宿主細胞發生融合的過程中起重要的作用。結構域III (EDIII)僅含ー個ニ硫鍵，具有受體結合活性，是JEV的ー個重要結構域。E蛋白單體在成熟的病毒表面以ニ聚體形勢存在，在酸性條件下可成為三聚體，這與病毒進入細胞的膜融合有夫。E蛋白具有神經毒性和神經侵襲力的致病位點，E蛋白上第138和第176位的氨基酸在こ型腦炎的減毒過程中起了重要作用，E138突變可引起E蛋白的ニ級結構的變化，這兩個位點的氨基酸突變可能改變了 E蛋白對細胞受體的吸附性，或者導致該病毒不能穿透其他細胞。E蛋白是中和作用的主要靶位點和JEV特異性抗體的作用位點，可激發中和抗體和保護性免疫。E蛋白還具有誘生血凝抑制抗體、補體結合抗體、中和抗體的功能，與特異性受體結合可粘附在細胞表面。日本腦炎E蛋白的第三個區域(EDIII)的空間結構已經解析，其結構顯示其空間結構整體呈“桶裝”結構，在其上端，下端有柔軟的loop封頂，有文獻報道上端的loop短肽在病毒與細胞受體結合，病毒的嗜性及病毒的毒力相關。因此我們初步確定及篩選NSK短肽，并驗證其潛在的抗病毒能力。

發明內容
本發明的目的是提供ー種具有抗日本腦炎病毒感染的三肽NSK。本發明的另ー目的是提供該三肽的應用。
本發明的目的可通過如下技術方案實現ー種具有抗日本腦炎病毒感染的三肽，其氨基酸序列為NSK。 本發明所述的三肽在抗日本腦炎病毒感染中的應用。有益效果根據日本腦炎病毒EDIII結構域從多個loop短肽中初步預測及篩選確定ー個小肽，序列是NSK。本發明采用人工合成的NSK三肽進行抗日本腦炎病毒的研究，該三肽作為潛在的抗病毒藥物與傳統的抗病毒化學藥物相比有以下幾個優點A此三肽合成方便、純度高有比較完善和成熟的合成方法，能較方便的進行人工合成及純化此人工合成的三肽經高效液相純化及質譜檢測，其純度可達95%以上(圖I)。
B無毒害物質此三肽屬于蛋白質小肽類，其不具有明顯的細胞毒性(圖2)。C抗病毒作用明顯該新型的三肽具有較好的抗病毒活性，在5 μ M濃度下，其在BHK-21細胞上具有半數抵抗(MOI=O. 02)日本腦炎病毒感染的作用。D具有潛在的臨床應用價值此三肽具備較好的潛在抗日本腦炎病毒及各種黃病毒科病毒的活性，因此為這些病毒疾病的治療和防制提供了可靠的依據。


圖INSK活性三肽在ΒΗΚ-21細胞上的細胞毒性的測定結果。圖2噬斑試驗測定NSK活性三肽在ΒΗΚ-21細胞上抑制日本腦炎病毒感染的活性。1(^11-10(^麗51(三肽預先與朋1(-21細胞4で孵育I小時后，用日本腦炎病毒接毒(MOI=O. 02) ΒΗΚ-21細胞，48小時后取上清用噬斑試驗測定滴度。圖3熒光定量測定NSK活性三肽在ΒΗΚ-21細胞上抑制日本腦炎病毒感染的活性。10 μ Μ-100 μ匪SK活性三肽預先與ΒΗΚ-21細胞4°C孵育I小時后，再用日本腦炎病毒接毒(Μ0Ι = O. 02)BHK-21細胞，48小時后提取病毒RNA，進行熒光定量PCR測定。圖4 Western blot測定活性三肽在BHK-21細胞上抑制日本腦炎病毒感染的活性。10 μ Μ-100 μ M NSK三肽預先與ΒΗΚ-21細胞4°C孵收集細胞，再用日本腦炎病毒接毒(Μ0Ι =0.02)BHK-21細胞，48小時后收取細胞，分別用針對JEV囊膜E蛋白的單抗及β-actin的單抗進行檢，β-actin作為內參。圖5 NSK活性三肽可以保護BALB/C小鼠免受日本腦炎病毒感染
具體實施例方式試驗材料日本腦炎病毒SA14-14-2疫苗株購自上海生物制品公司，Escherichia coliDH5a, BL21 表達菌株均購自上海英俊公司；CytoTox 96 Non-Radioactive CytotoxicityAssay試劑盒購白promega公司，其他所用化學試劑及試劑盒均購白Takara公司；BHK_21細胞(倉鼠腎細胞)購自上海然泰生物科技有限公司，BALB/C小鼠購自上海生エ公司。實施例I通過分析日本腦炎病毒的E蛋白第三個區域EDIII，篩選出EDIII “桶裝”結構上端的一個柔軟loop肽，在初歩確定此loop肽抗日本腦炎病毒活性的基礎上，運用丙氨酸替換的方法將此loop上的各個氨基酸(丙氨酸除外)突變為丙氨酸，然后將各個突變體EDIII進行原核可溶性表達純化，然后測定各個突變體EDIlI的抗日本腦炎病毒的活性，通過與未突變的EDIII抗病毒活性相比，確定NSK是具有潛在抑制日本腦炎病毒活性的短肽。我們通過人工合成的方法合成NSK，并經過高效液相色譜純化(4. 6X250_的C18柱，流動相A :水+0. 1% TFA B こ腈+0. I % TFA)，其出峰時間為3. 238分鐘，通過質譜檢測此三肽分子量為347. 78，純度為95%。實施例2 NSK三肽在BHK-21細胞上的細胞毒性的測定結果BHK-21細胞記數后用含10%小牛血清的DMEM營養液稀釋到適當的密度，以2X103/孔的濃度滴加到96孔板，置于37°C，5% CO2培養箱中待細胞貼壁成單層(約17-18h)后用含2%小牛血清的DMEM營養液將合成的NSK小肽進行稀釋200 μ Μ，100 μ Μ,50 μ Μ, 25 μ Μ, 10 μ Μ,每個濃度做五個重復，在96孔細胞培養板上將稀釋的NSL小肽樣品以100 μ I/孔分別預處理ΒΗΚ-21細胞24和48h后，分別取50 μ I上清，250g,離心5分鐘， 然后轉移到酶標板孔中，然后用CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒(promega公司)進行檢測,在酶標板中490nm,讀取數據(圖I),由圖2可見經NSK三肽(不同濃度200 μ M，100 μ M，50 μ M，25 μ M，10 μ M)處理的細胞釋放到上清中的LDH (乳酸脫氫酶)的量與未經NSK三肽處理的細胞釋放到上清中的量相比，兩者沒有明顯的差別，說明NSK在ΒΗΚ-21細胞上不具有明顯的細胞毒性。實施例3活性三肽在ΒΗΚ-21細胞上抑制日本腦炎病毒感染的活性(噬斑試驗，熒光定量 PCR, Western blot)(I)噬斑試驗測定活性三肽在BHK-21細胞上抑制日本腦炎病毒感染的活性BHK-21細胞記數后用含10 %小牛血清的DMEM營養液稀釋到適當的密度，以2X104/孔的濃度滴加到24孔板，置于37°C，5% CO2培養箱中待細胞貼壁成單層(約17-18h)。三肽NSK和打亂順序對照肽SNK用無血清DMEM稀釋到特定濃度后10 μ Μ-100 μ Μ,預先與ΒΗΚ-21細胞4°C孵育I小時后，再用日本腦炎病毒SA14-14-2疫苗株(購自上海生物制品公司)接毒(MOI=O. 02) BHK-21細胞，37°C，5% CO2培養箱孵育2小時，用PBS洗三遍，加2%小牛血清的DMEM維持夜500ul，置于37°C，5% CO2培養箱中培養48小時后，取上清，進行10倍比稀釋后，接種到鋪有單層的BHK-21的6空板中，37°C，5% CO2培養箱孵育2小時，用PBS洗三遍，加入含有2%小牛血清的1%低熔點瓊脂糖，37°C，5% CO2培養箱培養3-5天，用I %結晶紫室溫染色30分鐘，然后進行空斑計數，結果顯示NSK都能產生明顯抑制JEV感染，通過Microsoft Excel軟件曲線擬合的方法得出半數抑制濃度為5 μ Μ，并且具有明顯的計量依賴性(圖2)。(2)熒光定量測定活性三肽在ΒΗΚ-21細胞上抑制日本腦炎病毒感染的活性ΒΗΚ-21細胞記數后用含10 %小牛血清的DMEM營養液稀釋到適當的密度，以2 X IO4/孔的濃度滴加到24孔板，置于37 °C，5 % CO2培養箱中待細胞貼壁成單層(約17-18h)。三肽NSK及打亂順序對照肽SNK先用無血清DMEM稀釋到特定濃度后10μΜ-100μΜ，·*~ΒΗΚ-21細胞4°C孵育I小時后，再用日本腦炎病毒接毒(MOI=O. 02)BHK-21細胞，37 °C，5% CO2培養箱孵育2小時，用PBS洗三遍，加2%小牛血清的DMEM維持夜500ul，置于37°C，5% CO2培養箱中培養48小時后，提取病毒DNA。用Takara公司病毒DNA提取試劑盒按其操作說明書提取JEVRNA，溶于30ml超純水中，用于SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測。在ABI公司7300型全自動實時熒光定量PCR儀上擴增并檢測熒光。同時采用肌動蛋白(β-actin)基因作為內參。所用的PCR引物β-actin_F:5-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3 (SEQ ID NO. I)；β -actin-R:5-ATGGAGCCACCGATCCACA-3 (SEQ ID NO. 2); JEV-NS 1_F: 5-ACACTCGTCAGATCACAGGTTCA-3 (SEQ ID NO. 3) ；JEVNS 1-R: 5-GCCAGAAACATCACCAGAAGG-3 (SEQ ID NO. 4)。25 μ L PCR 反應體系中含 2X SYBRGreen PCR MasterMix 12. 5 μ L，10pmol/L 的上、下游引物各 I μ L，DNA 2 μ L, 2. 5mMdNTP2 μ L，TaqDNA 聚合酶 0· 25μ L，超純水 6· 25 μ し擴增參數為95°C 30s，95°C 10s、55°C 15s、72 °C 30s，共40個循環。反應結束后，進行熔解曲線的測定，反應條件為95°C 15s、60 °C lmin、95°C 15s,60 °C 15s。反應結束后通過 ABIPRISM7300SDS software (AppliedBiosystems)軟件分析數據。本實驗中采用2_Λ 法進行PRV的相對定量。即提取単獨接毒JEV的DNA作10倍梯度稀釋(稀釋范圍為10°-10_6)的樣品做出標準曲線，由此確定各組所用的稀釋度，同時測得各組樣品的ct值，然后采用相對定量公式，經內參基因GAPDH的內均一化處理后即可算出各組樣品相對于單獨接毒JEV樣品的表達量。結果顯示NSK都能產生明顯抑制JEV感染，并且具有明顯的計量依賴性(圖3)。 (3) Western blot測定活性三肽在BHK-21細胞上抑制日本腦炎病毒感染的活性BHK-21細胞記數后用含10 %小牛血清的DMEM營養液稀釋到適當的密度，以2 X IO4/孔的濃度滴加到24孔板，置于37 °C，5 % CO2培養箱中待細胞貼壁成單層(約17-18h)。三肽NSK先用無血清DMEM稀釋到特定濃度后10 μ Μ-100 μ M，預先與BHK-21細胞4°C孵育I小時后，再用日本腦炎病毒接毒(Μ0Ι=0. 02)BHK-21細胞，37°C，5% CO2培養箱孵育2小時，用PBS洗三遍，加2%小牛血清的DMEM維持夜500ul，置于37°C，5% CO2培養箱中培養48小時后，棄去上清，加200ulPBS，凍融三次后，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度，進行SDS-PAGE分析，確保每空總蛋白量一祥多，然后轉印PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，然后PBST洗三次，每次10分鐘，分別用抗JEV囊膜E蛋白的單抗，及β -actin的抗體進行孵育，室溫2小時，然后PBST洗三次，毎次10分鐘，然后用過氧化物酶標記的羊抗小鼠ニ抗(I :5000)進行檢測，室溫I小時，然后PBST洗三次，用ECL發光試劑盒進行曝光檢測(圖4)。由圖5可見，BHK-21細胞感染こ腦病毒的E蛋白的量隨著NSK三肽濃度的減少有明顯的增多，說明病毒的量隨著NSK三肽濃度的增多有明顯的減少，與對照相比此三肽有明顯的抑制活性，并具有計量依賴性。實施例3活性三肽在小白鼠模型上抑制日本腦炎病毒感染的活性2周齡的BALB/c小鼠,飼養一周后,此三肽30mg/kg預先腹腔注射小白鼠，I小時后，再經腹腔攻毒(5倍的LD50病毒量)，同時設PBS (不攻毒)，PBS (僅攻毒)對照，6天后，對照組開始死亡，8天全部死亡，試驗組成活率仍為90%，然后持續觀察21天，試驗組成活率為25% (圖5A)。此外此三肽2mM的濃度，預先腦部注射小白鼠30ul，I小時后，再經腦部攻毒(2倍的LD50病毒量)，同時設PBS (不攻毒)，PBS (僅攻毒)對照，4天后全部死亡，試驗組成活率仍為90%，然后持續觀察21天，試驗組成活率為70%。其結果說明此三肽(NSK)能明顯提高致死劑量JEV攻毒后，小白鼠的成活率(圖5B)。
權利要求
1.一種具有抗日本腦炎病毒感染的三肽，其氨基酸序列為NSK。
2.權利要求I所述的三肽在抗日本腦炎病毒感染中的應用。
全文摘要
本發明屬于抗病毒生物制品技術領域，公開了一種具有抗日本腦炎病毒感染的三肽及其應用。根據日本腦炎病毒EDIII結構域的loop肽中篩選確定一個三肽，其序列為NSK。體外實驗結果顯示用此肽預處理BHK-21細胞，能明顯干擾及抑制日本腦炎病毒的感染；體內實驗結果表明先腹腔或腦部給藥此三肽再用致死劑量的日本腦炎病毒攻擊BALB/c小白鼠后，能明顯提高小鼠的成活率。
文檔編號C07K5/093GK102827248SQ20121035842
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月24日 優先權日2012年9月24日
發明者茅翔, 李晨, 于亞玲, 葛玲玲, 王月, 孫明霞 申請人:南京農業大學