本發明涉及藥學領域，特別涉及一種抗菌藥材的篩選方法。
背景技術：
篩選高效的抗菌藥物仍然是治療細菌性傳染病的最主要方法。在測試致病性細菌對某一藥物的敏感性時，常用的方法有紙片法、牛津杯法、試管二倍稀釋法、平板二倍稀釋法等。目前上述四種檢測方法存在操作繁瑣、工作量大、周期長、培養條件不一致等問題，不能快速地確定致病菌株對各藥物的敏感性。尤其在初步篩選抗菌中藥時，植物藥材種類繁多，每種藥材預先要粗提其有效部位，并去除萃取溶劑，操作程序更復雜、耗時更長。
技術實現要素：
基于此，需要提供一種針對多菌種可同步進行初篩抗菌中藥的快速簡便的藥敏試驗方法。
為解決上述問題，發明人提供了一種抗菌藥材的篩選方法，包括如下步驟：
在培養基中加入經超微粉碎處理的抗菌藥材，以制成預設濃度梯度的藥敏培養基；
在所述藥敏培養基上接種致病菌，并將培養預設時間后供菌落形成的最低濃度作為待篩藥材的最低抑菌濃度。
進一步地，所述的抗菌藥材的篩選方法中，在培養基中加入經超微粉碎處理的抗菌藥材的形式包括：加入經超微粉碎的抗菌藥材，或，加入含有預設濃度的經超微粉碎的抗菌藥材的藥液。
進一步地，所述的抗菌藥材的篩選方法中，所述經超微粉碎的抗菌藥材的尺寸為5-10μm。
進一步地，所述的抗菌藥材的篩選方法中，所述步驟“加入含有預設濃度抗菌藥材的藥液”具體包括：將抗菌藥材的超微粉末加蒸餾水在高壓滅菌鍋中蒸煮，所得物經離心處理后提取上清液。
進一步地，所述的抗菌藥材的篩選方法中，加入經超微粉碎的抗菌藥材的初始添加濃度為6g/mL。
進一步地，所述的抗菌藥材的篩選方法中，加入含有預設濃度的經超微粉碎的抗菌藥材的藥液的初始添加濃度為1g/mL。
進一步地，所述的抗菌藥材的篩選方法中，在步驟“制成預設濃度梯度的藥敏培養基”和步驟“在所述藥敏培養基上接種致病菌”間還包括步驟：對所述藥品培養基進行滅菌處理。
進一步地，所述的抗菌藥材的篩選方法中，所述預設時間為24小時。
進一步地，所述的抗菌藥材的篩選方法中，在28℃的溫度條件下培養24小時。
進一步地，所述的抗菌藥材的篩選方法中，步驟“在所述藥敏培養基上接種致病菌”具體包括：將致病菌制備為107CFU/mL的菌液，以各2μL的劑量接種于所述藥敏培養基上，每一塊藥敏培養基上接種9株致病菌。
區別于現有技術，上述技術方案具有操作簡便、快捷、耗時短、處理量大(即每一個90mm平皿可同時檢測9-12株致病菌對藥物的敏感度)，試驗成本低，以及藥敏試驗結果準確可靠等優點，是一種高效率的藥敏試驗方法，在試驗研究中具有很好的應用價值，為開發和應用抗菌植物藥提供有益參考。
具體實施方式
為詳細說明本發明的技術內容、構造特征、所實現目的及效果，以下結合實施方式詳予說明。
第一實施例
一種抗菌藥材的篩選方法，包括如下步驟：
S1、在培養基中加入經超微粉碎處理并保證顆粒尺寸位于5-10μm的抗菌藥材，以初始添加濃度6g/mL開始進行二倍稀釋，配置為不同濃度梯度的藥敏培養基，并進行121℃、20min的滅菌處理。
S2、將致病菌制備為107CFU/mL的菌液，以各2μL的劑量接種于所述藥敏培養基上，每一塊藥敏培養基上接種9株病原菌。、
S3、在28℃的溫度條件下培養24小時，然后將培養預設時間后供菌落形成的最低濃度作為作為待篩藥材的最低抑菌濃度。
第二實施例
S1、以蒸餾水和經超微粉碎處理并保證顆粒尺寸位于5-10μm的抗菌藥材配制為濃度為1g/mL的混合物在高壓滅菌鍋中蒸煮，所得混合物經離心處理后提取上清液。
S2、對所提取的上清液進行二倍稀釋，配置為不同濃度梯度的藥敏培養基，并進行121℃、20min的滅菌處理。
S3、將致病菌制備為107CFU/mL的菌液，以各2μL的劑量接種于所述藥敏培養基上，每一塊藥敏培養基上接種9株病原菌。、
S4、在28℃的溫度條件下培養24小時，然后將培養預設時間后供菌落形成的最低濃度作為作為待篩藥材的最低抑菌濃度。
發明人同時以濾紙片法和平板二倍稀釋法對上述二實施例所述的方法進行了對照，三種方法的具體實施還包括相同的其他條件或過程如下：
所使用的藥品與試劑：五倍子(Galla Chinensis，縮寫GC，產地湖北)、石榴皮(Pomegranate Rind，縮寫PR，產地安徽)、大黃(Rhubarb Officinale，縮寫RO，產地甘肅)、黃芩(Baical Skullcap Root，縮寫BSR，產地河北)、虎杖(Rhizoma Polygoni Cuspidati，縮寫RPC，產地福建)、黃連(Golden Thread，縮寫GT，產地四川)、連翹(Weeping Forsythia Capsule，縮寫WFC，產地江西)、知母(Common Anemarrhena Rhizome，縮寫CAR，產地河北)、首烏藤(Caulis Polygoni Multiflori，縮寫CPM，產地江蘇)、地榆(Radix Sanguisorbae，縮寫RS，產地福建)、貫眾(Dryopteris Setosa，縮寫DS，產地四川)、金銀花(Flos Lonicerae，縮寫FL，產地遼寧)、紫花地丁(Purpleflower Violet，縮寫PV，產地河南)；馬齒莧(Portulaca Oleracea Linn，縮寫POL，產地福建)、苦楝皮(Cortex Meliae，縮寫CM，產地四川)，國藥控股福建有限公司；標準肉湯培養基(Mueller-Hinton Broth，M-H)，廣東環凱微生物科技有限公司(批號：201111072)。
致病菌菌株：9株氣單胞菌均為廈門市漁用藥物工程技術研究中心從漳浦、莆田、龍巖、福清等養殖場病鰻中分離得到，并經人工感染試驗證實為致病菌，同時菌株進行生理生化和基因鑒定，分別確定為氣單胞菌屬(Aeromonas sp.B01、B19)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae B14)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila B10、B15、B18、B20、B27)、腸棕氣單胞菌(Aeromonas enteropelgenes B09)。
菌懸液制備：從保種斜面上挑取菌苔劃線接種M-H瓊脂(Mueller-Hinton Agar)平板，置于28℃恒溫培養箱內培養20h；挑取單個菌落劃線至新鮮斜面上，28℃培養24h后，用無菌生理鹽水將菌體沖洗下來，采用酶標儀測定菌液濃度，測定波長為600nm。采用菌落計數法確定細菌濁度與吸光度OD600的關系，不同菌株的菌液OD600值約為0.2～0.3時，對應活菌計數值約為108CFU/mL，將菌液濃度稀釋10倍調至107CFU/mL，即可作為藥敏試驗接種的菌懸液。
中藥高壓浸提液的制備：稱取50g的中藥超微粉，加蒸餾水300mL置于20kHz超聲處理40min后，置于高壓滅菌鍋中煎煮(110℃、10min，95℃、30min)提取，然后用50mL離心管分裝，用冷凍離心機8000rpm離心10min，取上清液，放置4℃冰箱保存備用。
采用實施例一或二所述技術方案測定9株氣單胞菌對15種常用中藥的敏感度，實驗結果見表1，可見其中五倍子的抑菌效果最佳，其次是首烏藤、地榆，再次為石榴皮、貫眾、大黃、黃芩、虎杖，其余中藥的抑菌效果極差。B01、B27對五倍子極度敏感，其余7株菌為高度敏感；除B19、B20對首烏藤顯示中度敏感外，其余7株菌均表現為高度敏感；B10對地榆顯示低度敏感，B01、B14、B27為中度敏感，B09、B15、B18、B19、B20均為高度敏感；B15、B18、B19、B20、B27對石榴皮顯示中度敏感，僅B01、B09表現高度敏感，B10顯示低度敏感，而B14顯現不敏感；B20對貫眾不敏感，B09、B27顯示低度敏感，B10、B14、B15、B19顯示對貫眾中度敏感，B01、B18對貫眾顯示高度敏感；除B01、B10、B15對大黃中度敏感外，其余均為低度敏感；9株氣單胞菌對黃芩均呈現低度敏感。9株氣單胞菌對虎杖的敏感性差異很大，B01、B10、B14、B18表現為高度敏感，但其余菌株均不敏感。
表1超微藥粉瓊脂稀釋法測定各種中藥的最低抑菌濃度(藥物濃度單位：μg/mL)
從作為對照的紙片法和稀釋法的結果來看：
平板二倍稀釋法與紙片法所使用的藥物都是液體，在做藥敏試驗之前同樣都要通過耗時較長、操作較復雜的中藥提取工序。而本發明所述的技術方案只需將中藥藥材進行超微粉碎處理即可，步驟簡單。由于藥材粉碎顆粒足夠細，達到了5-10μm，保證藥材中的有效成分在瓊脂培養基中可以充分溶出無需再考慮有效成分提取率高低對藥敏結果的負面影響。
比較本發明所述技術方案與稀釋法的實驗結果可見：本發明所述技術方案測得平均最低抑菌濃度均低于平板二倍稀釋法，靈敏度明顯增加。雖然這兩種方法在抑菌濃度上測得數據有差異，個別菌株的敏感度級別發生變化，但不同中藥對某一株致病菌的抑制效應強弱是一致的。
本發明實施例所述技術方案測定的中藥MIC值均低于平板二倍稀釋法，原因在于平板二倍稀釋法使用的是中藥高壓水提液，而本發明實施例所述技術方案使用的是中藥超微粉；采用水煎煮、高壓抽提、超聲提取、微波提取或有機溶劑萃取等中藥粗提方法，均無法將中藥植物藥材細胞內的有效成分完全溶出，故降低了抑菌效果；而本法將中藥超微粉直接添加入瓊脂培養基，在進行抑菌藥敏試驗過程中，微米級顆粒的藥粉一直存在于細菌培養基內，不斷釋放抗菌有效成分，可達到較高的抑菌作用。故可避免由于中藥粗提方法選擇不當，造成有效物質提取率低，而容易在初步篩選時將高效的抗菌藥材遺漏等問題。
再進行紙片法與超微藥粉瓊脂稀釋法的比較：針對9株致病菌從15種中藥篩選出具有高效抑菌作用的藥材，采用藥敏紙片法需要制備81個瓊脂平板；而本發明實施例所述技術方案只需要45個瓊脂平板。兩者相比，篩選工作量顯著減少，操作更快捷，試驗材料費大大降低。
前期預試驗結果顯示，由于受紙片上藥物含量的限制，低敏感度和不敏感的中藥對致病菌均不產生抑菌圈，且考慮到實驗操作量，只選擇抑菌效果較好又存在差異的3種中藥(五倍子、地榆、石榴皮)和有代表性的4株致病菌進行比較試驗。從實驗結果可見采用本發明實施例所述技術方案測得有效抑菌濃度低于紙片法，即靈敏度相應提高，然而4株致病菌對中藥五倍子、地榆、石榴皮的分級敏感程度與紙片法檢測結果一致，同樣體現了超微藥粉瓊脂稀釋法的可靠性和高靈敏性。
綜上比較說明，本發明提供的抗菌藥材篩選方法具有操作簡便、快捷、耗時短、處理量大(即每一個90mm平皿可同時檢測9-12株致病菌對藥物的敏感度)，試驗成本低，以及藥敏試驗結果準確可靠等優點，是一種高效率的藥敏試驗方法，在試驗研究中具有很好的應用價值，同時為開發和應用抗菌植物藥提供有益參考。
以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利保護范圍，凡是利用本發明說明書內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的技術領域，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。