本發明屬于領域，具體涉及一種培養基底的修飾方法及使用該方法的間充質干細胞分離擴增方法。
背景技術：
：干細胞是指生物體內能夠進行自我更新，并維持機體各組織細胞新陳代謝的一群細胞。同時，在生物體內各種組織受到內源或外源性的損害時，干細胞可以被激活執行分化功能，從而達到修復該組織的目的。間充質干細胞在適當的條件下，具有強大的增值能力和分化能力，能夠修復多種組織損傷，包括骨骼，肌肉，神經等組織，因此，間充質干細胞在再生醫學治療領域引起了越來越多的重視。骨髓當中含有豐富的間充質干細胞，因此得到了最為廣泛和深入的研究。研究證實，骨髓間充質干細胞表達特定的表面抗原表型，比如，CD45-，CD34-，CD29+，CD90+，CD73+和CD105+。在體外和體內環境中可向骨骼，軟骨，神經以及胰島等細胞分化。另外，骨髓間充質干細胞具有免疫調節的功能，分泌多種免疫相關信號分子，從而在免疫性疾病治療過程中發揮作用。但是，盡管骨髓間充質干細胞細胞較易分離和培養，但是，骨髓來源有限，難以滿足臨床大量的需求。即便是進行患者的自體移植，患者也必須承擔額外的痛苦。在其他組織，比如肌肉，脂肪，腦以及血液等其它組織也能分離獲得間充質干細胞。這些細胞有與骨髓間充質干細胞相似的抗原表型和分化能力。然而，除去血液外，應用其他組織的間充干細胞面臨著和應用骨髓間充質干細胞相同的問題，及樣品稀缺，不足以滿足臨場需求。已經證實，血液中含有活性很強的干細胞群，包括造血干細胞和間充質干細胞。血液中的間充質干細胞與骨髓干細胞相似，有著相同的表面抗原表型，以及相似的分化能力。文獻表明，血液干細胞有著更原始的干細胞特性和更低的免疫原性。同時，應用血液治療糖尿病，神經損傷以及血管壞死等疾病也屢見報道。但是，由于血液中間充質干細胞含量極低，如何高效分離和擴增這些細胞成為了阻礙血液間充質干細胞向臨床轉化的難題。技術實現要素：為了解決現有技術存在的上述問題，本發明提供了一種培養基底的修飾方法及使用該方法的間充質干細胞分離擴增方法。所述修飾方法，利用特定的高分子化學物質而不是使用成分難以確定的細胞外基質對培養容器進行修飾，配合適當的培養基，能夠實現間充質干細胞的高效分離擴增。本發明所采用的技術方案為：一種培養基底的修飾方法，包括以下步驟：A、將PEG和CYCLIC-RGD溶于氯仿中，得到修飾液；B、將修飾液均勻涂抹在培養容器的內表面；C、回收培養容器內表面上修飾液中的氯仿，得到內表面覆蓋有修飾層的培養容器。其中PEG為聚乙二醇，CYCLIC-RGD為環-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。使用被所述修飾方法修飾過得培養容器，能夠能夠實現間充質干細胞的高效分離擴增。作為一種回收氯仿的方式，步驟C中，將培養容器置于2-10℃的負壓下36-60小時，以完成氯仿的回收。采用低溫負壓的方式，是為了不破壞修飾液中的成分。為穩定修飾層及整個體系的pH值，優選的技術方案是，步驟C后還包括步驟D、向培養容器內加入磷酸鹽緩沖液，在震蕩下反應10-14小時，再使用磷酸鹽緩沖液沖洗。進一步地，步驟D中，向培養容器內加入磷酸鹽緩沖液，在震蕩下反應12小時，再使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，并繼續在震蕩下反應24小時后，使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次。根據本發明的實施例，步驟D中使用的磷酸鹽緩沖液的濃度為10mg/mL，pH值為8。為保證間充質干細胞分離擴增的順利進行，不被雜菌污染，優選的技術方案是，步驟D之后還包括步驟E、將培養容器使用環氧乙烷進行消毒處理。根據發明人的研究發現，所述PEG和CYCLIC-RGD的比例為1mL：0.1-0.005g時有較好的修飾效果，PEG和CYCLIC-RGD的比例為1mL：0.01g時，修飾效果最好，能夠起到最好的分離擴增間充質干細胞的效果。本發明還提供了一種使用所述修飾方法的間充質干細胞分離擴增方法，包括以下步驟：A、將血液和同體積的α-MEM培養基混合，并加入濃度為3-8g/L的甲基纖維素溶液，靜置30-40分鐘，得到細胞懸液；B、取所述細胞懸液的上清液，加至相對密度為1.077的淋巴細胞分離液上，并在2500-3000rpm的轉速下離心20-40min，取界面層，加入磷酸鹽緩沖液得到單細胞懸液；C、將所述單細胞懸液接種至經所述修飾方法修飾過得培養容器內進行培養，當細胞達到90％融合時，進行傳代培養并擴增。為了進一步提高間充質干細胞的培養效率，優選的技術方案是，步驟A中，向培養α-MEM培養基中添加0.5-2％的Pen-Strep，5-100ng/mL的b-FGF，5-100ng/mL的EGF和5-100ng/mL的TGF-β。其中，α-MEM為α-最小必需極限培養基；Pen-Strep為青霉素-鏈霉素，b-FGF為b-成纖維細胞生長因子，EGF為表皮細胞生長因子，TGF-β為轉化生長因子。本發明的有益效果為：本發明提供了一種培養基底的修飾方法及使用該方法的間充質干細胞分離擴增方法。所述修飾方法，利用特定的高分子化學物質而不是使用成分難以確定的細胞外基質對培養容器進行修飾，配合適當的培養基，能夠實現間充質干細胞的高效分離擴增。附圖說明圖1為應用實施例6所述經過高分子修飾基底的培養容器及培養方法分離擴增血液中間充質干細胞的相差顯微鏡圖片。可以看到細胞形態均一，均為紡錘形，狀態良好。具體實施方式下面結合實施例，更具體地說明本發明的內容。應當理解，本發明的實施并不局限于下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發明保護范圍。在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。實施例1一種培養基底的修飾方法，包括以下步驟：A、將PEG和CYCLIC-RGD溶于氯仿中，得到修飾液；所述PEG和CYCLIC-RGD的比例為1mL：0.1g；B、將修飾液均勻涂抹在培養容器的內表面；C、將培養容器置于10℃的負壓下36小時，回收培養容器內表面上修飾液中的氯仿，得到內表面覆蓋有修飾層的培養容器；D、向培養容器內加入磷酸鹽緩沖液，在震蕩下反應12小時，再使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，并繼續在震蕩下反應24小時后，使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為10mg/mL，pH值為8；E、將培養容器自然干燥后使用環氧乙烷進行消毒處理，備用。實施例2一種培養基底的修飾方法，包括以下步驟：B、將PEG和CYCLIC-RGD溶于氯仿中，得到修飾液；所述PEG和CYCLIC-RGD的比例為1mL：0.005g；B、將修飾液均勻涂抹在培養容器的內表面；C、將培養容器置于2℃的負壓下60小時，回收培養容器內表面上修飾液中的氯仿，得到內表面覆蓋有修飾層的培養容器；D、向培養容器內加入磷酸鹽緩沖液，在震蕩下反應12小時，再使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，并繼續在震蕩下反應24小時后，使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為10mg/mL，pH值為8；E、將培養容器自然干燥后使用環氧乙烷進行消毒處理，備用。實施例3一種培養基底的修飾方法，包括以下步驟：C、將PEG和CYCLIC-RGD溶于氯仿中，得到修飾液；所述PEG和CYCLIC-RGD的比例為1mL：0.01g；B、將修飾液均勻涂抹在培養容器的內表面；C、將培養容器置于6℃的負壓下48小時，回收培養容器內表面上修飾液中的氯仿，得到內表面覆蓋有修飾層的培養容器；D、向培養容器內加入磷酸鹽緩沖液，在震蕩下反應12小時，再使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，并繼續在震蕩下反應24小時后，使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為10mg/mL，pH值為8；E、將培養容器自然干燥后使用環氧乙烷進行消毒處理，備用。實施例4一種使用實施例1所述修飾方法的間充質干細胞分離擴增方法，包括以下步驟：A、無菌條件下，將臍帶血和同體積的α-MEM培養基混合，向培養α-MEM培養基中添加0.5％的Pen-Strep，100ng/mLb-FGF，5ng/mLEGF和100ng/mLTGF-β；得到培養液，并濃度為3g/L的甲基纖維素溶液，甲基纖維素溶液與所述培養液的體積比為4:1；靜置40分鐘，得到細胞懸液；B、取所述細胞懸液的上清液，加入磷酸鹽緩沖液，加至相對密度為1.077的淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque上，并在2750rpm的轉速下離心40min，取界面層，加入磷酸鹽緩沖液得到單細胞懸液；因為Ficoll-Hypaque的比重為1.077g/ml，其比單核細胞重但比紅細胞輕，因此可以將單核細胞與殘留的紅細胞分離。收集界層面即可收集到比較純的單核細胞。C、將所述單細胞懸液接種至經所述修飾方法修飾過得培養容器內進行培養，具體方式為：隨后，使用添加10％胎牛血清的臍帶血間充質干細胞培養基均勻打散收集到的細胞，臍帶血間充質干細胞培養基是指在添加0.5％的Pen-Strep，100ng/mL的b-FGF，5ng/mL的EGF和100ng/mL的TGF-β等生長因子的α-MEM培養基。細胞打散后，接種于實施例1制備的培養容器(細胞培養板)，7天后更換培養基，洗滌培養板，除去未貼壁細胞，繼續使用添加10％胎牛血清的臍帶血間充質干細胞培養基培養，每7天換液一次，直至細胞接近90％融合。將90％融合細胞用胰酶進行消化，接種于未經實施例1處理過的培養板，使用10％胎牛血清的臍帶血間充質干細胞培養基培養，3天換液一次。直至融合，并進行下一次傳代。當細胞達到90％融合時，進行傳代培養并擴增。實施例5一種使用實施例2所述修飾方法的間充質干細胞分離擴增方法，包括以下步驟：A、無菌條件下，將臍帶血和同體積的α-MEM培養基混合，向培養α-MEM培養基中添加2％的Pen-Strep，5ng/mLb-FGF，100ng/mLEGF和5ng/mLTGF-β；得到培養液，并濃度為8g/L的甲基纖維素溶液，甲基纖維素溶液與所述培養液的體積比為4:1；靜置35分鐘，得到細胞懸液；B、取所述細胞懸液的上清液，加入磷酸鹽緩沖液，加至相對密度為1.077的淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque上，并在3000rpm的轉速下離心30min，取界面層，加入磷酸鹽緩沖液得到單細胞懸液；因為Ficoll-Hypaque的比重為1.077g/ml，其比單核細胞重但比紅細胞輕，因此可以將單核細胞與殘留的紅細胞分離。收集界層面即可收集到比較純的單核細胞。C、將所述單細胞懸液接種至經所述修飾方法修飾過得培養容器內進行培養，具體方式為：隨后，使用添加10％胎牛血清的臍帶血間充質干細胞培養基均勻打散收集到的細胞，臍帶血間充質干細胞培養基是指在添加2％的Pen-Strep，5ng/mL的b-FGF，100ng/mL的EGF和5ng/mL的TGF-β等生長因子的α-MEM培養基。細胞打散后，接種于實施例2制備的培養容器(細胞培養板)，7天后更換培養基，洗滌培養板，除去未貼壁細胞，繼續使用添加10％胎牛血清的臍帶血間充質干細胞培養基培養，每7天換液一次，直至細胞接近90％融合。將90％融合細胞用胰酶進行消化，接種于未經實施例2處理過的培養板，使用10％胎牛血清的臍帶血間充質干細胞培養基培養，3天換液一次。直至融合，并進行下一次傳代。當細胞達到90％融合時，進行傳代培養并擴增。實施例6一種使用實施例3所述修飾方法的間充質干細胞分離擴增方法，包括以下步驟：A、無菌條件下，將臍帶血和同體積的α-MEM培養基混合，向培養α-MEM培養基中添加1％的Pen-Strep，50ng/mLb-FGF，10ng/mLEGF和10ng/mLTGF-β；得到培養液，并濃度為5g/L的甲基纖維素溶液，甲基纖維素溶液與所述培養液的體積比為4:1；靜置30分鐘，得到細胞懸液；B、取所述細胞懸液的上清液，加入磷酸鹽緩沖液，加至相對密度為1.077的淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque上，并在2500rpm的轉速下離心20min，取界面層，加入磷酸鹽緩沖液得到單細胞懸液；因為Ficoll-Hypaque的比重為1.077g/ml，其比單核細胞重但比紅細胞輕，因此可以將單核細胞與殘留的紅細胞分離。收集界層面即可收集到比較純的單核細胞。C、將所述單細胞懸液接種至經所述修飾方法修飾過得培養容器內進行培養，具體方式為：隨后，使用添加10％胎牛血清的臍帶血間充質干細胞培養基均勻打散收集到的細胞，臍帶血間充質干細胞培養基是指在添加1％的Pen-Strep，50ng/mL的b-FGF，10ng/mL的EGF和10ng/mL的TGF-β等生長因子的α-MEM培養基。細胞打散后，接種于實施例3制備的培養容器(細胞培養板)，7天后更換培養基，洗滌培養板，除去未貼壁細胞，繼續使用添加10％胎牛血清的臍帶血間充質干細胞培養基培養，每7天換液一次，直至細胞接近90％融合。將90％融合細胞用胰酶進行消化，接種于未經實施例3處理過的培養板，使用10％胎牛血清的臍帶血間充質干細胞培養基培養，3天換液一次。直至融合，并進行下一次傳代。當細胞達到90％融合時，進行傳代培養并擴增。實施例7本實施例FACs(流式細胞熒光分選技術)對實施例6中擴增得到的干細胞進行表面抗原檢測，結果如表1所示。表1表面抗原檢測結果表指示劑反應CD34-CD45-CD3-CD73+CD105+CD90+表1證實，對于實施例6所分離和培養的干細胞，CD34、CD45及CD3為陰性，而CD73、CD105及CD90為陽性。此結果表明實施例6所分離并擴增的細胞是間充質干細胞。最后所應說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，所應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施方式而已，并不用于限定本發明的保護范圍，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3