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一組用于雞源性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的特異性引物和探針的制作方法

文檔序號(hào):11145807閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一組用于雞源性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的特異性引物和探針,其特征在于:所述特異性引物和探針的核苷酸序列為(1)或(2)中的一種:

(1)、上游引物:5'- TCCTCCACAAATCTAAACAACGAAC -3'

下游引物:5'- ATGATGAAGGGGTGTTCTACTGG -3'

探針:5'- TAACCTTCCGACCACTCTCCCAAAC -3'

所述引物和探針擴(kuò)增的目標(biāo)核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.3;

(2)、與(1)所述序列互補(bǔ)的序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物和探針,其特征在于:所述探針的5’端熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM,3’端標(biāo)記的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。

3.雞源性的PCR檢測(cè)試劑盒,所述試劑盒為雞源性的定性或定量檢測(cè)試劑盒;其特征在于:所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物和探針;

作為優(yōu)選,所述定量檢測(cè)試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品,所述標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為:將雞源性保守基因片段插入到載體pMD18-T中,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得含有雞源性保守基因片段的重組質(zhì)粒,以此作為標(biāo)準(zhǔn)品;所述雞源性保守基因片段為序列表中SEQ ID No.2;

作為進(jìn)一步優(yōu)選,所述雞源性保守基因片段是以序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列為模板,使用下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的:

上游引物:5'- CGATTCTTCGCTTTACACTTC -3'

下游引物:5'- TGATGATGAAGGGGTGTTCTA -3';

作為優(yōu)選,所述PCR擴(kuò)增的條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s,35個(gè)循環(huán);72℃ 10min。

4.權(quán)利要求1或2所述的特異性引物和探針在制備定性或定量檢測(cè)雞源性的試劑盒中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用,其特征在于:所述應(yīng)用是分別以標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品DNA為模板,利用特異性引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品的Ct值判定結(jié)果。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于:所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件為:94℃ 預(yù)變性2分鐘,94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號(hào),40個(gè)循環(huán)。

7.雞源性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法,所述檢測(cè)方法不以有生命的人體或動(dòng)物體為直接實(shí)施對(duì)象,其特征在于:步驟如下:

(1)制備標(biāo)準(zhǔn)品:將雞源性保守基因片段插入到載體pMD18-T中,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得含有雞源性保守基因片段的重組質(zhì)粒,以此作為標(biāo)準(zhǔn)品;所述雞源性保守基因片段為序列表中SEQ ID No.2;

(2)使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對(duì)待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品采用相同的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增;

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制;

(4)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品的Ct值進(jìn)行雞源性的快速定量檢測(cè)。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法,其特征在于:步驟(1)中所述雞源性保守基因片段是通過(guò)以下引物擴(kuò)增得到的:

上游引物為5'- CGATTCTTCGCTTTACACTTC -3';

下游引物為5'- TGATGATGAAGGGGTGTTCTA -3';

作為優(yōu)選,PCR擴(kuò)增所述雞源性保守基因片段的條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s,35個(gè)循環(huán);72℃ 10min;

作為優(yōu)選,步驟(2)中所述引物和探針的用量均為1.6μl;

作為優(yōu)選,步驟(2)中所述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94℃ 預(yù)變性2分鐘,94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號(hào),40個(gè)循環(huán)。

9.雞源性的定性PCR檢測(cè)方法,所述檢測(cè)方法不以有生命的人體或動(dòng)物體為直接實(shí)施對(duì)象,其特征在于:步驟如下:

(1)使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增;

(2)通過(guò)待測(cè)樣品的Ct值對(duì)雞源性進(jìn)行定性檢測(cè):當(dāng)Ct值小于38時(shí),為陽(yáng)性;否則,為陰性;

作為優(yōu)選,步驟(1)中所述引物和探針的用量均為1.6μl;

作為優(yōu)選,步驟(1)中所述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94℃ 預(yù)變性2分鐘,94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號(hào),40個(gè)循環(huán)。

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