本發(fā)明涉及一種多環(huán)芳烴降解基因工程菌株、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在過(guò)去的十幾年內(nèi)，應(yīng)用基因工程菌(GEB)進(jìn)行環(huán)境修復(fù)的研究進(jìn)展比較緩慢。單從技術(shù)角度來(lái)講，研究學(xué)者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的可以用于生物修復(fù)的遺傳系統(tǒng)，通過(guò)基因工程改造微生物的相關(guān)代謝系統(tǒng)可以大大提高其對(duì)污染物的降解效率，因此GEB往往都具有良好的特異性降解能力。而真正限制GEB應(yīng)用于環(huán)境修復(fù)的因素往往是其未知與不可控的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，這些菌株所攜帶的外源抗性基因一旦通過(guò)水平轉(zhuǎn)移進(jìn)入其他生物體內(nèi)，可能造成較為嚴(yán)重的抗性基因污染，同時(shí)GEB多為外來(lái)物種，其生長(zhǎng)代謝是否會(huì)對(duì)土著微生物群落產(chǎn)生影響，均存在較大的不確定性。

為了解決上述問(wèn)題，GEB在應(yīng)用于環(huán)境修復(fù)前往往需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜而漫長(zhǎng)的評(píng)估過(guò)程。如何將其改造得易監(jiān)測(cè)、可控制是未來(lái)基因工程菌構(gòu)建技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)。研究表明，向GEB中導(dǎo)入可調(diào)控的自毀系統(tǒng)(Active biological containment systems，ABC)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)菌株的人為誘導(dǎo)衰亡，該方法主要是通過(guò)調(diào)控導(dǎo)入的自殺基因得以實(shí)現(xiàn)。具有ABC系統(tǒng)的細(xì)菌一旦遇到誘導(dǎo)物質(zhì)，其攜帶的自殺基因則會(huì)通過(guò)破壞細(xì)胞膜、降解核酸物質(zhì)等方式啟動(dòng)自殺機(jī)制。雖然該系統(tǒng)功能的發(fā)揮會(huì)受到誘導(dǎo)物質(zhì)接觸程度、細(xì)菌胞內(nèi)蛋白表達(dá)量等多方面因素的影響，無(wú)法保證100％的致死率，但該系統(tǒng)對(duì)實(shí)現(xiàn)人為控制GEB在環(huán)境中的生長(zhǎng)、防范其擴(kuò)散仍具有極大地應(yīng)用潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)應(yīng)用基因工程菌進(jìn)行土壤修復(fù)過(guò)程中潛在的抗性基因污染及外源菌株擴(kuò)散等生物安全風(fēng)險(xiǎn)，本發(fā)明提供一種具有誘導(dǎo)自毀機(jī)制的多環(huán)芳烴降解基因工程菌、其構(gòu)建方法、應(yīng)用以及自毀效率檢驗(yàn)方法。

一種多環(huán)芳烴降解基因工程菌株，該菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期是2016年09月19日，保藏編號(hào)：CGMCCNo.13014，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

進(jìn)一步地：

所述構(gòu)建方法包括以下步驟：

1)lac啟動(dòng)子與核酸酶基因nuc的融合

以pAH12質(zhì)粒為模板，采用引物nuc-f與nuc-r擴(kuò)增核酸酶基因nuc。隨后采用Nde I和Hind III酶分別酶切擴(kuò)增產(chǎn)物及pUC-18質(zhì)粒，16℃連接過(guò)夜，構(gòu)建pUC-nuc載體，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽(yáng)性克隆；菌落PCR及酶切驗(yàn)證后，提取質(zhì)粒，采用引物lacnuc-f與lacnuc-r擴(kuò)增連接有上游lac啟動(dòng)子及操縱子的nuc基因，得到lacnuc融合基因；

2)重組轉(zhuǎn)座子載體pUT-lacnuc的構(gòu)建

切膠回收后lacnuc融合基因的PCR產(chǎn)物并進(jìn)行純化，采用Not I酶進(jìn)行酶切，同時(shí)切割質(zhì)粒pUT-mini Tn5(Km)；連接酶切產(chǎn)物，得到重組質(zhì)粒pUT-lacnuc；

3)基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3的構(gòu)建

采用三親結(jié)合的方式將融合基因lacnuc重組至Pseudomonas putida GLB3染色體，操作所需菌株如下：受體菌(Pseudomonas putida GLB3)、輔助菌(E.coli DH5α(pRK2073))、供體菌(E.coli DH5α(pUT-lacnuc))；培養(yǎng)至菌落可見(jiàn)后，通過(guò)菌落PCR及陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后的質(zhì)粒酶切進(jìn)行鑒定，篩選構(gòu)建成功的基因工程菌株。

步驟3)中各菌株混合比例為1:1:1，混合體系采用10mM MgSO4溶液，所用平板培養(yǎng)基應(yīng)為含有卡那霉素25mg/L及氯霉素25mg/L的LB平板培養(yǎng)基。

各步驟應(yīng)用的引物序列如下：

一種所述的多環(huán)芳烴降解基因工程菌株用于實(shí)現(xiàn)應(yīng)用基因工程菌GEB的人為誘導(dǎo)衰亡，控制GEB在環(huán)境中的生長(zhǎng)的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，使用被異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)自毀的功能進(jìn)行誘導(dǎo)自毀。

一種將所述的多環(huán)芳烴降解基因工程菌株的構(gòu)建方法用于實(shí)現(xiàn)應(yīng)用基因工程菌GEB的人為誘導(dǎo)衰亡，控制GEB在環(huán)境中的生長(zhǎng)的應(yīng)用。

一種針對(duì)所述應(yīng)用的誘導(dǎo)自毀效率檢驗(yàn)方法，包括以下步驟：

挑取含有融合基因lacnuc的重組菌單菌落接種于LB肉湯，30℃培養(yǎng)，待OD₆₀₀值達(dá)到0.6時(shí)，吸取10ml菌懸液轉(zhuǎn)移至滅菌離心管，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)自殺，使其最終濃度為12mg/L，繼續(xù)于30℃培養(yǎng)，按照一定的間隔時(shí)間取樣測(cè)定OD₆₀₀值并取100μl稀釋1:400后的菌懸液接種于含有氯霉素25mg/L的LB平板培養(yǎng)基，30℃過(guò)夜培養(yǎng)后對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)；同時(shí)采用含有pUC-nuc質(zhì)粒的E.coli JM109及不含ABC系統(tǒng)的受體菌Pseudomonas putida GLB3分別作為陽(yáng)性與陰性對(duì)照，進(jìn)行相同誘導(dǎo)自殺實(shí)驗(yàn)。

進(jìn)一步地，用于E.coli JM109稀釋菌液接種的LB平板采用氨芐青霉素100mg/L取代卡那霉素。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果有：

本發(fā)明在原位解析雨水花園中PAHs污染特征及微生物群落結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，以其中篩選出的土著優(yōu)勢(shì)菌種Pseudomonas putida GLB3為受體菌(GenBank accession No.KT804567)，選擇Serratia marcescens菌株攜帶的核酸酶基因(nuc)及l(fā)ac啟動(dòng)子構(gòu)建ABC系統(tǒng)。先將nuc基因片段連接至pUC-18載體lac啟動(dòng)子下游，通過(guò)PCR擴(kuò)增lac啟動(dòng)子及nuc基因，得到lacnuc融合片段。進(jìn)而插入至pUT/mini-Tn5轉(zhuǎn)座載體，通過(guò)其轉(zhuǎn)座子將上述片段重組入Pseudomonas putida GLB3菌株的基因組，實(shí)現(xiàn)ABC系統(tǒng)的構(gòu)建。從而，本發(fā)明有效提高基因工程菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中的可控性，降低應(yīng)用其進(jìn)行微生物強(qiáng)化修復(fù)過(guò)程中的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例電泳照片，以nuc-f和nuc-r為引物擴(kuò)增nuc片段，擴(kuò)增產(chǎn)物大小801bp。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例電泳照片，以Nde I與Hind III酶切pUC-nuc載體。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例電泳照片，以lacnuc-f和lacnuc-r進(jìn)行PCR擴(kuò)增lacnuc片段，擴(kuò)增產(chǎn)物大小970bp。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例電泳照片，以lacnuc-f和lacnuc-r進(jìn)行PCR鑒定pUT-lacnuc載體中的lacnuc片段。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例電泳照片，以Not I酶切pUT-lacnuc載體，酶切產(chǎn)物大小為7.1kb與0.97kb。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例電泳照片，以lacnuc-f和lacnuc-r進(jìn)行PCR鑒定重組菌基因組及質(zhì)粒DNA是否攜帶lacnuc片段，擴(kuò)增產(chǎn)物大小970bp。

圖7是本發(fā)明實(shí)施例基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3、受體菌Pseudomonas putida GLB3與含有pUC-nuc質(zhì)粒的菌株E.coli JM109在IPTG誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)條件下的生長(zhǎng)曲線。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例提供一種假單胞菌基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3。菌種保藏編號(hào)：CGMCCNo.13014。假單胞菌基因工程菌株的構(gòu)建方法是利用從受多環(huán)芳烴污染的雨水花園土壤中篩選出的土著優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)seudomonas putida GLB3(GenBank accession No.KT804567)作為受體菌，將Serratia marcescens菌株攜帶的核酸酶基因(nuc)連接至lac啟動(dòng)子下游構(gòu)后，通過(guò)三親結(jié)合的方法將上述融合基因?qū)胧荏w菌基因組，實(shí)現(xiàn)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)對(duì)菌株的誘導(dǎo)后自毀功能。對(duì)比基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3、受體菌Pseudomonas putida GLB3與含有pUC-nuc質(zhì)粒的菌株E.coli JM109在誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)條件下的生長(zhǎng)能力，證明基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3在人為進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)后，表現(xiàn)出了明顯了衰亡效應(yīng)。由此，證明本發(fā)明可有效提高基因工程菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中的人為可控性，降低其應(yīng)用過(guò)程中的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明實(shí)施例的基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3的構(gòu)建及誘導(dǎo)自殺效率評(píng)價(jià)方法，如下：

1、lac啟動(dòng)子與核酸酶基因nuc的融合

以pAH12質(zhì)粒為模板，采用引物nuc-f與nuc-r擴(kuò)增核酸酶基因nuc。隨后采用Nde I和Hind III酶分別酶切擴(kuò)增產(chǎn)物及pUC-18質(zhì)粒，16℃連接過(guò)夜，構(gòu)建pUC-nuc載體，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽(yáng)性克隆。菌落PCR及酶切驗(yàn)證后，提取質(zhì)粒，采用引物lacnuc-f與lacnuc-r擴(kuò)增連接有上游lac啟動(dòng)子及操縱子的nuc基因，得到lacnuc融合基因。

2、重組轉(zhuǎn)座子載體pUT-lacnuc的構(gòu)建

切膠回收后lacnuc融合基因的PCR產(chǎn)物并進(jìn)行純化，采用Not I酶進(jìn)行酶切，同時(shí)切割質(zhì)粒pUT-mini Tn5(Km)。連接酶切產(chǎn)物，得到重組質(zhì)粒pUT-lacnuc。

3、基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3的構(gòu)建

采用三親結(jié)合的方式將融合基因lacnuc重組至Pseudomonas putida GLB3染色體，操作所需菌株如下：受體菌(Pseudomonas putida GLB3)、輔助菌(E.coli DH5α(pRK2073))、供體菌(E.coli DH5α(pUT-lacnuc))。各菌株混合比例為1:1:1，混合體系采用10mM MgSO₄溶液，所用平板培養(yǎng)基應(yīng)為含有卡那霉素(25mg/L)及氯霉素(25mg/L)的LB平板培養(yǎng)基。培養(yǎng)至菌落可見(jiàn)后，通過(guò)菌落PCR及陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后的質(zhì)粒酶切進(jìn)行鑒定，篩選構(gòu)建成功的基因工程菌株。

4、基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3的誘導(dǎo)自殺效率研究

挑取含有融合基因lacnuc的重組菌單菌落接種于LB肉湯，30℃培養(yǎng)，待OD₆₀₀值達(dá)到0.6時(shí)，吸取10ml菌懸液轉(zhuǎn)移至滅菌離心管，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)自殺，使其最終濃度為12mg/L，繼續(xù)于30℃培養(yǎng)，按照一定的間隔時(shí)間取樣測(cè)定OD₆₀₀值并取100μl稀釋后(1:400)的菌懸液接種于含有氯霉素(25mg/L)的LB平板培養(yǎng)基，30℃過(guò)夜培養(yǎng)后對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。同時(shí)采用含有pUC-nuc質(zhì)粒的E.coli JM109及不含ABC系統(tǒng)的受體菌Pseudomonas putida GLB3分別作為陽(yáng)性與陰性對(duì)照，進(jìn)行相同誘導(dǎo)自殺實(shí)驗(yàn)(用于E.coli JM109稀釋菌液接種的LB平板采用氨芐青霉素(100mg/L)取代卡那霉素)。

上述各步驟中所用引物名稱、序列及作用如下：

實(shí)施例1：lac啟動(dòng)子與核酸酶基因nuc的融合

以引物nuc-f和nuc-r擴(kuò)增nuc片段；PCR反應(yīng)體系(50μl)：模板DNA1.0μl；HS Premix(寶生工，大連)25.0μl；50μM引物0.5μl；ddH₂O 23.0μl；PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；(94℃預(yù)變性30s—57℃退火5s—72℃延伸90s)×30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1(圖1：PCR擴(kuò)增nuc基因，其中M：5000bp DNA Marker，1：nuc基因片段)。凝膠電泳成像可見(jiàn)特異性擴(kuò)增條帶，片段長(zhǎng)度預(yù)期(801bp)相符。使用Nde I和Hind III酶切載體pUC-18以及nuc片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，連接后得到質(zhì)粒pUC-nuc轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中擴(kuò)增提取質(zhì)粒后，可以以其為模板擴(kuò)增出nuc片段，使用Nde I和Hind III酶切可見(jiàn)pUC-18載體以及nuc片段(參見(jiàn)圖2：pUC-nuc載體的PCR與酶切鑒定，其中M：5000bp DNA Marker，1：Nde I與Hind III酶切產(chǎn)物)。以載體pUC-nuc為模板，使用引物lacnuc-f與lacnuc-r擴(kuò)增包含上游lac啟動(dòng)子及操縱子的的nuc基因，PCR反應(yīng)體系同上，反應(yīng)程序中退化溫度變更為59℃。得到與預(yù)期一致的特異性擴(kuò)增片段(970bp)(參見(jiàn)圖3：pMD-lacnuc載體的PCR與酶切鑒定，其中M：5000bp DNA Marker，1：PCR擴(kuò)增lacnuc片段)。

實(shí)施例2：重組轉(zhuǎn)座子載體pUT-lacnuc的構(gòu)建

使用Not I限制性內(nèi)切酶酶切l(wèi)acnuc基因及載體pUT/mini-Tn5Km，酶切產(chǎn)物純化后回收l(shuí)acnuc片段與pUT/mini-Tn5Km連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5αλpir中。挑取平板上的陽(yáng)性克隆利用引物lacnuc-f與lacnuc-r進(jìn)行菌落PCR進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果呈陽(yáng)性(見(jiàn)圖4：pUT-lacnuc載體的PCR驗(yàn)證，其中M：10000bp DNA Marker，1：lacnuc基因片段)；同時(shí)，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行Not I酶切，凝膠電泳結(jié)果顯示在7.1kb與1kb處附近存在兩條條帶(見(jiàn)圖5：pUT-lacnuc載體的酶切鑒定，其中M：5000bp DNA Marker，1：Not I酶切產(chǎn)物)，分別對(duì)應(yīng)pUT/mini-Tn5Km質(zhì)粒與lacnuc基因，證明pUT-lacnuc重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

實(shí)施例3：基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3的構(gòu)建

采用三親結(jié)合的方式將融合基因lacnuc的重組至Pseudomonas putida GLB3染色體，操作所需菌株如下：受體菌(Pseudomonas putida GLB3)、輔助菌(E.coli DH5α(pRK2073))、供體菌(E.coli DH5α(pUT-lacnuc))。各菌株混合比例為1:2:1，混合體系采用10mM MgSO₄溶液，所用平板培養(yǎng)基應(yīng)為含有卡那霉素(25mg/L)及氯霉素(25mg/L)的LB平板培養(yǎng)基。培養(yǎng)至菌落可見(jiàn)后，挑取菌落，采用引物lacnuc-f與lacnuc-r進(jìn)行l(wèi)acnuc 基因的菌落PCR驗(yàn)證。圖6表明lacnuc基因已成功轉(zhuǎn)化入受體菌Pseudomonas putida GLB3，將該重組菌命名為Pseudomonas putida GLEB3(保藏號(hào)CGMCCNo.13014)。在含有氯霉素的LB培養(yǎng)基中增殖重組菌Pseudomonas putida GLEB3，分別提取其基因組DNA與質(zhì)粒DNA，并以此為模板，使用引物lacnuc-f與lacnuc-r擴(kuò)增lacnuc基因。重組菌Pseudomonas putida GLEB3的基因組可以擴(kuò)增出lacnuc基因片段，而提取的質(zhì)粒DNA則無(wú)法擴(kuò)增(圖6：三親結(jié)合重組菌的PCR驗(yàn)證及l(fā)acnuc基因的定位，其中M：10000bp DNA Marker，1，4：基因組的lacnuc基因擴(kuò)增驗(yàn)證，2，3：提取質(zhì)粒后lacnuc基因擴(kuò)增驗(yàn)證)，說(shuō)明lacnuc基因在重組菌株生長(zhǎng)的過(guò)程中已經(jīng)整合至細(xì)菌基因組。

實(shí)施例4：基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3的誘導(dǎo)自殺效率研究

挑取含有融合基因lacnuc的重組菌單菌落及接種于LB肉湯，30℃培養(yǎng)，待OD₆₀₀值達(dá)到0.6時(shí)，吸取1ml菌懸液轉(zhuǎn)移至滅菌離心管，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)自殺，使其最終濃度為12mg/L，繼續(xù)于30℃培養(yǎng)，按照一定的間隔時(shí)間取樣測(cè)定OD₆₀₀值并取100μl稀釋后(1:400)的菌懸液接種于含有氯霉素(25mg/L)的LB平板培養(yǎng)基，30℃過(guò)夜培養(yǎng)后對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。同時(shí)采用含有pUC-nuc質(zhì)粒的E.coli JM109及不含ABC系統(tǒng)的基因工程菌Pseudomonas putida GLEB3分別作為陽(yáng)性與陰性對(duì)照，進(jìn)行相同誘導(dǎo)自殺實(shí)驗(yàn)(用于E.coli JM109稀釋菌液接種的LB平板采用氨芐青霉素(100mg/L)取代卡那霉素)，結(jié)果見(jiàn)(圖7：菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3、Pseudomonas putida GLB3與含有pUC-nuc質(zhì)粒的菌株E.coli JM109在IPTG誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)條件下的生長(zhǎng)曲線)。

菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3在整合入lacnuc后，在未受IPTG條件誘導(dǎo)的情況下，生長(zhǎng)曲線與原菌株幾乎一致，說(shuō)明以野生菌株P(guān)seudomonas putida GLB3為受體構(gòu)建的基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3體內(nèi)可以表達(dá)lacI阻遏蛋白，ABC系統(tǒng)的構(gòu)建并未影響菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3在正常情況條件下的生長(zhǎng)。而在接受IPTG誘導(dǎo)后，菌株P(guān)seudomonas putida GLEKB3的生長(zhǎng)速率顯著下降，生長(zhǎng)曲線提前進(jìn)入平臺(tái)期。結(jié)合表1中對(duì)應(yīng)的存活菌落數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)曲線進(jìn)入平臺(tái)期后隨時(shí)間增長(zhǎng)，存活的菌落數(shù)顯著下降。對(duì)比接受IPTG誘導(dǎo)的原始菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3則未發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)象，初步證明是重組入其基因組的lacnuc基因賦予了其被IPTG誘導(dǎo)自殺能力，IPTG實(shí)現(xiàn)了對(duì)菌株體內(nèi)lacI阻遏蛋白阻斷，從而啟動(dòng)了lac啟動(dòng)子下游基因的表達(dá)。針對(duì)含有pUC-nuc質(zhì)粒的菌株E.coli JM109的誘導(dǎo)試驗(yàn)產(chǎn)生了與菌株P(guān)seudomonas putida GLEKB3相似的結(jié)果：菌株在IPTG誘導(dǎo)后，生長(zhǎng)速率顯著降低，并在一段時(shí)間后停止生長(zhǎng)。由此可以驗(yàn)證菌株P(guān)seudomonas putida GLEKB3的IPTG誘導(dǎo)自殺能力是由重組入其基因組的lacnuc基因?qū)е拢關(guān)seudomonas putida GLEB3體內(nèi)的ABC系統(tǒng)構(gòu)建成功。

表1：菌株P(guān)seudomonas putida GLKB3、Pseudomonas putida GLB3與含有pUC-nuc質(zhì)粒的菌株E.coli JM109在不同誘導(dǎo)時(shí)間后的存活菌落數(shù)比較

本發(fā)明利用的受體菌株是在深圳光明新區(qū)低影響示范工程雨水花園土壤中獲得的一株惡臭假單胞菌菌株P(guān)seudomonas putida GLB3為受體菌(GenBank accession No.KT804567)，經(jīng)高通量測(cè)序解析土壤生物群落結(jié)構(gòu)確定該菌株所在屬別為優(yōu)勢(shì)菌屬。核酸酶nuc攜帶質(zhì)粒pAH12由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所伍一軍教授及德國(guó)奧爾登堡大學(xué)Wackernagel教授饋贈(zèng)。本發(fā)明應(yīng)用基因工程手段，將來(lái)自pAH12質(zhì)粒的核酸水解酶編碼基因連接至pUC-18載體的lac啟動(dòng)子下游，并擴(kuò)增lacnuc融合基因后通過(guò)三親結(jié)合的方式重組至受體菌基因組，以實(shí)現(xiàn)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)對(duì)重組菌株的誘導(dǎo)自毀功能，提高基因工程菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中的可控性，降低應(yīng)用其進(jìn)行微生物強(qiáng)化修復(fù)過(guò)程中的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的/優(yōu)選的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，其還可以對(duì)這些已描述的實(shí)施例做出若干替代或變型，而這些替代或變型方式都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 清華大學(xué)深圳研究生院

<120> 一種多環(huán)芳烴降解基因工程菌株、其構(gòu)建方法及應(yīng)用

<130> 16A100483JYC

<160> 2

<210> 1

<211> 801

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcgcttta acaacaagat gttggccctg gccgccctgc tgttcgccgc tcaggcgtcg 60

gccgacacgc tcgaatccat cgacaactgc gcggtcggct gcccgactgg tggcagcagc 120

aacgtgtcta tcgtgcgtca tgcttatacg ttgaacaaca acagtaccac caagttcgcc 180

aactgggtgg cttatcacat caccaaagac acgccggcca gcggcaagac gcgcaactgg 240

aaaaccgatc cggcgctcaa cccggcggac acgttagcgc ccgccgatta caccggcgcc 300

aatgcggcgc tgaaggtcga tcgcggtcat caggcgccgc tggcttcgct ggcgggcgtt 360

tccgactggg aatcgctgaa ctacctgtcc aacatcacgc cgcaaaagtc cgatcttaac 420

cagggcgcct gggcgcggct ggaagatcag gaacgcaagc tgatcgatcg cgccgatatc 480

tcctcggtct ataccgtgac cgggccgctg tatgaacgcg atatgggcaa actgccgggc 540

acccagaaag cgcataccat ccccagcgcc tactggaagg tgattttcat caacaacagc 600

ccggcggtga accactatgc cgccttcctg ttcgatcaga acacgccgaa gggcgccgat 660

ttctgccagt tccgcgtgac ggtggacgag atcgagaagc gtaccggcct gatcatctgg 720

gccggtctgc cggacgacgt gcaggcttcg ctgaagagca agcccggcgt cctgccggag 780

ttgatgggct gcaaaaactg a 801

<210> 2

<211> 946

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 60

cacaggaaac agctatgacc atgattacga attcgagctc ggtacccggg gatcctctag 120

agtcgacctg caggcatgca agcttatgcg ctttaacaac aagatgttgg ccctggccgc 180

cctgctgttc gccgctcagg cgtcggccga cacgctcgaa tccatcgaca actgcgcggt 240

cggctgcccg actggtggca gcagcaacgt gtctatcgtg cgtcatgctt atacgttgaa 300

caacaacagt accaccaagt tcgccaactg ggtggcttat cacatcacca aagacacgcc 360

ggccagcggc aagacgcgca actggaaaac cgatccggcg ctcaacccgg cggacacgtt 420

agcgcccgcc gattacaccg gcgccaatgc ggcgctgaag gtcgatcgcg gtcatcaggc 480

gccgctggct tcgctggcgg gcgtttccga ctgggaatcg ctgaactacc tgtccaacat 540

cacgccgcaa aagtccgatc ttaaccaggg cgcctgggcg cggctggaag atcaggaacg 600

caagctgatc gatcgcgccg atatctcctc ggtctatacc gtgaccgggc cgctgtatga 660

acgcgatatg ggcaaactgc cgggcaccca gaaagcgcat accatcccca gcgcctactg 720

gaaggtgatt ttcatcaaca acagcccggc ggtgaaccac tatgccgcct tcctgttcga 780

tcagaacacg ccgaagggcg ccgatttctg ccagttccgc gtgacggtgg acgagatcga 840

gaagcgtacc ggcctgatca tctgggccgg tctgccggac gacgtgcagg cttcgctgaa 900

gagcaagccc ggcgtcctgc cggagttgat gggctgcaaa aactga 946