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一組用于驢源性的實時熒光PCR檢測的特異性引物和探針的制作方法

文檔序號:11145809閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一組用于驢源性的實時熒光PCR檢測的特異性引物和探針,其特征在于:所述特異性引物和探針的核苷酸序列為(1)或(2)中的一種:

(1)、上游引物:5'-GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'

下游引物:5'- GGGCTGTGATGATAAAGGGTAGA -3'

探針:5'- CCTCCTATCAGCAATCCCCTACATCG-3'

所述引物和探針擴增的目標核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.3;

(2)、與(1)所述序列互補的序列。

2.根據權利要求1所述的引物和探針,其特征在于:所述探針的5’端熒光報告基團是FAM,3’端標記的是熒光淬滅基團TAMRA。

3.驢源性的PCR檢測試劑盒,所述試劑盒為驢源性的定性或定量檢測試劑盒;其特征在于:所述試劑盒包括權利要求1所述的引物和探針;

作為優選,所述定量檢測試劑盒還包括標準品,所述標準品的制備方法為:將驢源性保守基因片段插入到載體pMD18-T中,轉化至大腸桿菌中進行誘導表達,獲得含有驢源性保守基因片段的重組質粒,以此作為標準品;所述驢源性保守基因片段為序列表中SEQ ID No.2;

作為進一步優選,所述驢源性保守基因片段是以序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列為模板,使用下述引物進行PCR擴增獲得的:

上游引物:5'- GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3'

下游引物:5'- ATAGGAAATACCATTCTGGCTTA -3';

作為優選,所述PCR擴增的條件為:94℃預變性5min;94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s,35個循環;72℃ 10min。

4.權利要求1或2所述的特異性引物和探針在制備定性或定量檢測驢源性的試劑盒中的應用。

5.根據權利要求4所述的應用,其特征在于:所述應用是分別以標準品和待測樣品DNA為模板,利用特異性引物和探針進行實時熒光定量PCR,通過標準曲線和待測樣品的Ct值判定結果。

6.根據權利要求5所述的應用,其特征在于:所述實時熒光定量PCR的反應條件為:94℃ 預變性2分鐘,94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號,40個循環。

7.驢源性的實時熒光定量PCR檢測方法,所述檢測方法不以有生命的人體或動物體為直接實施對象,其特征在于:步驟如下:

(1)制備標準品:將驢源性保守基因片段插入到載體pMD18-T中,轉化至大腸桿菌中進行誘導表達,獲得含有驢源性保守基因片段的重組質粒,以此作為標準品;所述驢源性保守基因片段為序列表中SEQ ID No.2;

(2)使用權利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品和標準品采用相同的反應體系進行實時熒光PCR擴增;

(3)標準曲線繪制;

(4)通過標準曲線和待測樣品的Ct值進行驢源性的快速定量檢測。

8.根據權利要求7所述的檢測方法,其特征在于:步驟(1)中所述驢源性保守基因片段是通過以下引物擴增得到的:

上游引物為5'- GAGGAGCAACGGTCATTACAA -3';

下游引物為5'- ATAGGAAATACCATTCTGGCTTA -3';

作為優選,PCR擴增所述驢源性保守基因片段的條件為:94℃預變性5min;94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s,35個循環;72℃ 10min;

作為優選,步驟(2)中所述引物和探針的用量均為1.6μl;

作為優選,步驟(2)中所述實時熒光PCR擴增的反應條件為:94℃ 預變性2分鐘,94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號,40個循環。

9.驢源性的定性PCR檢測方法,所述檢測方法不以有生命的人體或動物體為直接實施對象,其特征在于:步驟如下:

(1)使用權利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品進行實時熒光PCR擴增;

(2)通過待測樣品的Ct值對驢源性進行定性檢測:當Ct值小于38時,為陽性;否則,為陰性;

作為優選,步驟(1)中所述引物和探針的用量均為1.6μl;

作為優選,步驟(1)中所述實時熒光PCR擴增的反應條件為:94℃ 預變性2分鐘,94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號,40個循環。

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