本發明涉及生物材料應用，特別是一種角蛋白特征肽在羚羊角摻假檢測中的應用流程。

背景技術：

羚羊角是我國傳統的名貴中藥，具有平肝息風、清肝明目、散血解毒的功效，臨床主要用于高熱驚厥，在對小兒發熱有很好的療效。藥典中規定羚羊角為牛科動物賽加玲羊Saiga tatarica Linnaeus的角。賽加羚羊數量稀少，屬于瀕危動物，是國家一級保護動物，已經嚴禁捕殺，這導致羚羊角的短缺，價格昂貴，一些不法商家在利益的驅動下在羚羊角粉末中摻入價格便宜的山羊角、綿羊角、水牛角、黃牛角。目前羚羊角成分的檢測方法主要是性狀和顯微鑒定法，性狀、顯微鑒別法雖然簡單快捷，但對于比較相近的角類藥材缺乏專屬性。

技術實現要素：

本發明的目的是為了解決上述問題，設計了一種角蛋白特征肽在羚羊角摻假檢測中的應用流程。

實現上述目的本發明的技術方案為，一種角蛋白特征肽在羚羊角摻假檢測中的應用流程，包括黃牛角、水牛角、山羊角和綿羊角共有的特征肽,所述特征肽的序列為SQQQEPLVCPNYQSYFR。

蛋白特征肽在羚羊角摻假檢測中的應用流程，包括如下步驟：

步驟一：將角類樣品采用胰蛋白酶酶解處理：取角樣品粉末1mg，加1ml水超聲10min，10000rpm離心10min收集沉淀；加1ml 50％乙醇超聲10min，10000rpm離心10min收集沉淀；加入0.5ml變性緩沖液；加入25μl 1M DTT；90℃處理1h，加入60μl 1M IAA，暗處反應1h，10000rpm離心10min，收集上清；取100μl上清加入10kd超濾管，10000rpm離心20min；加入0.4ml 25mM NH₄HCO₃洗滌3次；加100μ l25mM NH₄HCO₃溶液到超濾管中，加入2μg胰蛋白酶；37℃反應16h；10000rpm離心10min收集濾液。

步驟二：進行液質聯用分析：采用的色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.1％甲酸水溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，梯度洗脫：0→3min，流動相A為96％；3→8min，流動相A為96％→92％；8→10min，流動相A為92％→50％；10→12min，流動相A為50％；12→12.1min，流動相A為50％→95％；12.1→15min，流動相A為96％，流速為0.3ml/min。

步驟三：采用電噴霧正離子模式進行多反應監測，選擇離子對715.33→572.28，910.52進行MRM掃描。

步驟一中，所述變性緩沖液為6M鹽酸胍，1.2MTris-HCl，2.5m MEDTA，pH8.4

步驟二中，所述色譜柱的內徑為2.1mm。

步驟三中，所述電噴霧正離子模式以三重四極桿質譜作為檢測器。

步驟三中，所述電噴霧離子源為ESI+。

利用本發明的技術方案制作的一種角蛋白特征肽在羚羊角摻假檢測中的應用流程，液質聯用技術測定物種特異性蛋白質的的特征肽，從而對食品藥品進行物種溯源的方法已經比較成熟。角中含有大量的角蛋白，本發明提供一種山羊角、綿羊角、水牛角、黃牛角的角蛋白共有的特征肽用于羚羊角中摻偽的檢測方法，能夠快速的檢出羚羊角藥材中摻入的山羊角、綿羊角、水牛角、黃牛角成分。

附圖說明

圖1是本發明所述一種角蛋白特征肽在羚羊角摻假檢測中的應用流程的結構示意圖；

圖2是本發明所述一種角蛋白特征肽在羚羊角摻假檢測中的不同角類樣品中特征肽SQQQEPLVCPNYQSYFR的MRM色譜圖；

圖3是本發明所述一種角蛋白特征肽在羚羊角摻假檢測中的摻入不同角類藥材的羚羊角樣品中特征肽SQQQEPLVCPNYQSYFR的MRM色譜圖。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明進行具體描述，如圖1-3所示，一種角蛋白特征肽在羚羊角摻假檢測中的應用流程，包括黃牛角、水牛角、山羊角和綿羊角共有的特征肽,所述特征肽的序列為SQQQEPLVCPNYQSYFR；角蛋白特征肽在羚羊角摻假檢測中的應用流程，包括如下步驟：步驟一：將角類樣品采用胰蛋白酶酶解處理：取角樣品粉末1mg，加1ml水超聲10min，10000rpm離心10min收集沉淀；加1ml 50％乙醇超聲10min，10000rpm離心10min收集沉淀；加入0.5ml變性緩沖液；加入25μl 1M DTT；90℃處理1h，加入60μl 1M IAA，暗處反應1h，10000rpm離心10min，收集上清；取100μl上清加入10kd超濾管，10000rpm離心20min；加入0.4ml 25mM NH₄HCO₃洗滌3次；加100μl 25mM NH₄HCO₃溶液到超濾管中，加入2μg胰蛋白酶；37℃反應16h；10000rpm離心10min收集濾液；步驟二：進行液質聯用分析：采用的色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.1％甲酸水溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，梯度洗脫：0→3min，流動相A為96％；3→8min，流動相A為96％→92％；8→10min，流動相A為92％→50％；10→12min，流動相A為50％；12→12.1min，流動相A為50％→95％；12.1→15min，流動相A為96％，流速為0.3ml/min；步驟三：采用電噴霧正離子模式進行多反應監測，選擇離子對715.33→572.28，910.52進行MRM掃描；步驟一中，所述變性緩沖液為6M鹽酸胍，1.2M Tris-HCl，2.5mM EDTA，pH8.4；步驟二中，所述色譜柱的內徑為2.1mm；步驟三中，所述電噴霧正離子模式以三重四極桿質譜作為檢測器；步驟三中，所述電噴霧離子源為ESI+。

本實施方案的特點為，包括黃牛角、水牛角、山羊角和綿羊角共有的特征肽,所述特征肽的序列為SQQQEPLVCPNYQSYFR，角蛋白特征肽在羚羊角摻假檢測中的應用流程，包括如下步驟：步驟一：將角類樣品采用胰蛋白酶酶解處理：取角樣品粉末1mg，加1ml水超聲10min，10000rpm離心10min收集沉淀；加1ml 50％乙醇超聲10min，10000rpm離心10min收集沉淀；加入0.5ml變性緩沖液；加入25μl 1M DTT；90℃處理1h，加入60μl 1M IAA，暗處反應1h，10000rpm離心10min，收集上清；取100μl上清加入10kd超濾管，10000rpm離心20min；加入0.4ml 25mM NH₄HCO₃洗滌3次；加100μl 25mM NH₄HCO₃溶液到超濾管中，加入2μg胰蛋白酶；37℃反應16h；10000rpm離心10min收集濾液；步驟二：進行液質聯用分析：采用的色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.1％甲酸水溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，梯度洗脫：0→3min，流動相A為96％；3→8min，流動相A為96％→92％；8→10min，流動相A為92％→50％；10→12min，流動相A為50％；12→12.1min，流動相A為50％→95％；12.1→15min，流動相A為96％，流速為0.3ml/min；步驟三：采用電噴霧正離子模式進行多反應監測，選擇離子對715.33→572.28，910.52進行MRM掃描，液質聯用技術測定物種特異性蛋白質的的特征肽，從而對食品藥品進行物種溯源的方法已經比較成熟。角中含有大量的角蛋白，本發明提供一種山羊角、綿羊角、水牛角、黃牛角的角蛋白共有的特征肽用于羚羊角中摻偽的檢測方法，能夠快速的檢出羚羊角藥材中摻入的山羊角、綿羊角、水牛角、黃牛角成分。

在本實施方案中，試驗中使用的碳酸氫銨，胰蛋白酶購自Sigma公司、乙腈、甲酸購自Merck公司。所有試劑均為色譜純。角蛋白特征肽在羚羊角摻假檢測中的應用流程，包括如下步驟：步驟一：將角類樣品采用胰蛋白酶酶解處理：取角樣品粉末1mg，加1ml水超聲10min，10000rpm離心10min收集沉淀；加1ml 50％乙醇超聲10min，10000rpm離心10min收集沉淀；加入0.5ml 6M鹽酸胍，1.2M Tris-HCl，2.5mM EDTA，pH8.4的變性緩沖液；加入25μl 1M DTT；90℃處理1h，加入60μl 1M IAA，暗處反應1h，10000rpm離心10min，收集上清；取100μl上清加入10kd超濾管，10000rpm離心20min；加入0.4ml 25mM NH₄HCO₃洗滌3次；加100μl 25mM NH₄HCO₃溶液到超濾管中，加入2μg胰蛋白酶；37℃反應16h；10000rpm離心10min收集濾液；步驟二：進行液質聯用分析：采用的色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，其色譜柱的內徑為2.1mm；以0.1％甲酸水溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，梯度洗脫：0→3min，流動相A為96％；3→8min，流動相A為96％→92％；8→10min，流動相A為92％→50％；10→12min，流動相A為50％；12→12.1min，流動相A為50％→95％；12.1→15min，流動相A為96％，流速為0.3ml/min；步驟三：采用電噴霧正離子模式進行多反應監測，其電噴霧正離子模式以三重四極桿質譜作為檢測器，選擇離子對715.33→572.28，910.52進行MRM掃描，其電噴霧離子源為ESI+，角中含有大量的角蛋白，本發明提供一種山羊角、綿羊角、水牛角、黃牛角的角蛋白共有的特征肽用于羚羊角中摻偽的檢測方法，能夠快速的檢出羚羊角藥材中摻入的山羊角、綿羊角、水牛角、黃牛角成分。

在本實施方案中，實施例1，角類樣品的檢測：

稱取1mg角類樣品粉末按照樣品處理方法和液相質譜方法分析樣品，檢測結果如圖2。

在本實施方案中，實施例2，羚羊角藥材中其他角類成分的檢測：

《中國藥典》2015年版中規定，藥屑雜質通常不得過3％的要求，考慮到質譜儀器的檢測誤差，本實施例在羚羊角粉末中摻入了3％的其他角類樣品，具體為稱取3mg角類樣品粉末加入到97mg羚羊角粉末中混勻，稱取混勻的角類樣品粉末按照樣品處理方法和液相質譜方法分析樣品，檢測結果如圖3。

上述技術方案僅體現了本發明技術方案的優選技術方案，本技術領域的技術人員對其中某些部分所可能做出的一些變動均體現了本發明的原理，屬于本發明的保護范圍之內。