本發明屬生命科學和生物技術領域，特別涉及檢測與先天性角化不良癥有關的基因突變的引物和方法。

背景技術：

先天性角化不良癥(dskeratosiseongenita，DC)是一種具有遺傳異質性的骨髓衰竭綜合征，發病率約為1/100萬。典型的DC患者約80％～90％具有皮膚黏膜異常三聯征，表現為皮膚網狀色素沉著、指(趾)甲萎縮、口腔黏膜白斑。目前文獻報道可引起DC的突變基因主要有CTC1，DKC1，TERC，TERT，TINF2，NHP2，NOP10及WRAP53。文獻報道，這些基因有3種遺傳方式，分別為X-連鎖隱性遺傳、常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳。但目前仍約50％患者遺傳特征不明確。X-連鎖隱性遺傳包括DKC1，常染色體顯性遺傳包括TERC及TINF2，常染色體隱性遺傳包括CTC1，WRAP53，NHP2，NOP10，既可以作為常染色體顯性遺傳又可以作為隱性遺傳的有TERT。

端粒酶卡扎爾體蛋白1(telomerase cajal body protein 1，TCAB1又名WRAP53、WDR79)是2009年新發現的端粒酶關鍵核心蛋白組分，其主要存在于卡扎爾體蛋白中。WRAP53基因定位于染色體17p13上，共有10個外顯子，與P53基因重疊，是P53的反義轉錄基因，它不僅能調節p53基因的表達還能調節端粒的合成。WRAP53表達的缺失不會影響端粒酶活性及TERC水平，但可在細胞的S期阻止端粒酶與端粒結合，最終導致端粒變短。Zhong等發現WRAP53的突變阻止了端粒酶定位于卡扎爾體蛋白，導致了先天性角化不良癥的發生。近年來，通過全基因組測序，發現WRAP53基因突變在先天性角化不良癥患者中非常常見。目前文獻報道在兩個先天性角化不良癥的家族中發現WRAP53基因存在4個突變點，分別為F164L(第2外顯子)、H376Y(第7外顯子)、R398W(第8外顯子)、G435R(第9外顯子)。目前國內文獻報道的DC病例絕大多數為30歲左右皮膚受累的臨床病例，病例數較少，且較少進行基因檢測。因此有必要進行相關基因的突變檢測，有必要先對患者進行WRAP53基因進行全外顯子突變篩選，有助于對先天性角化不良癥的早期診斷，減少誤診、漏診，并進行治療。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種檢測遺傳性WRAP53基因多態突變熱點的引物，采用PCR技術，可用于快速檢測先天性角化不良癥患者體內WRAP53基因多態位點的突變情況。所述檢測WRAP53基因多態熱點突變情況的引物，包括：

擴增WRAP53基因的引物，其堿基序列為：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

進一步地，還包括測序引物，其堿基序列為：

檢測WRAP53基因的測序引物堿基序列為：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG

進一步地，引物序列WRAP53-Exon1A-F、WRAP53-Exon1A-R、WRAP53-Exon1B-F、WRAP53-Exon1B-R、WRAP53-Exon1C-R以及WRAP53-Exon1C-F是擴增WRAP53基因第1外顯子序列的引物，引物序列WRAP53-Exon2-F和WRAP53-Exon2-R是擴增WRAP53基因第2外顯子序列的引物，以此類推，引物序列WRAP53-Exon10-F和WRAP53-Exon10-R是擴增WRAP53基因第10外顯子序列的引物。

本發明還提供了檢測WRAP53基因全外顯子突變情況的方法，包括以下步驟：

1.抽提外周血中的基因組DNA；

2.用PCR擴增步驟1中提取的DNA；

3.對步驟2中的擴增產物進行測序；

4.對測序結果進行判斷，確定WRAP53基因是否發生突變；

其中PCR擴增引物為：

擴增WRAP53基因的引物，其堿基序列為：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

進一步地，還包括測序引物，其堿基序列為：

檢測WRAP53基因的測序引物堿基序列為：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG

本發明還提供了一種檢測WRAP53基因多態突變位點的試劑盒，包括：

(i)全血基因組DNA抽提試劑；

(ii)檢測體系PCR擴增反應液；

(iii)測序體系試劑；

其中PCR擴增反應液引物為：

擴增WRAP53基因的引物，其堿基序列為：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

進一步地，測序引物堿基序列為：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG

有益效果：本發明設計了擴增WRAP5310個外顯子序列的引物。通過加接頭，使所有13對引物的PCR產物均可以用一種測序引物進行測序。采用PCR技術，構建了穩定的擴增體系。通過調整引物濃度、退火溫度等反應條件，可使擴增效率達到最佳。WRAP53基因的突變類型種類多且遍布整個基因，因此本發明所述引物既能將所述WRAP53全部外顯子序列都擴增出來，也保證無論這些外顯子的何處位置發生突變，都不會出現漏檢的情況。相比較熒光定量PCR法降低了檢測的成本和難度。熒光定量PCR法要針對不同的突變類型設計多個探針，成本高，檢測難度大。本發明的13對引物涵蓋了WRAP53基因全部外顯子區域，使得后續測序時的上下游引物均能測出目的片段，一定程度上保證了測序的準確性。

附圖說明

圖1為WRAP53基因在染色體上定位圖。

圖2和圖3為WRAP53基因經13對引物擴增后所得產物的電泳圖譜，每對引物的擴增均設有一個重復，M為Marker DL 2000，如圖2和圖3所示，引物擴增有效，且條帶單一。

圖4為樣本4WRAP53基因第2號外顯子引物擴增后的產物正反向測序圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本發明。應當注意的是，實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。

實施例1

一種檢測WRAP53基因多態突變位點的引物，該引物的設計是針對WRAP53全外顯子設計的擴增引物，包括：

擴增WRAP53基因全外顯子序列的引物，其堿基序列為：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

一種檢測WRAP53基因多態突變位點的試劑盒，包括

(i)全血基因組DNA抽提試劑；

(ii)檢測體系PCR反應液；

(iii)測序體系試劑；

其中，外周血基因組DNA提取所用試劑盒由天根生物科技有限公司提供。

檢測體系PCR擴增反應液包括：

測序體系試劑包括：

實施例2

血液/細胞/組織基因組DNA抽提試劑盒(天根生物)的操作流程：

(1)全血基因組DNA提取

1)于1.5ml離心管底部加入20μl QIAGEN Protease(或proteinase K)。.

2)離心管中加入200μl血漿。

3)加入200μl Buffer AL，振蕩15s。(注意：不可將QIAGEN Protease或proteinase K直接加入到Buffer AL中。若樣本量較大，則QIAGEN Protease和Buffer AL按比例增加。)

4)56℃水浴10min，之后短暫離心，以除去離心管蓋內沿的液體。

5)加入200μl乙醇(96％-100％)，振蕩15s，短暫離心，以去除離心管蓋內沿液體。

6)小心將以上所得混合液(包括沉淀物)小心加入到QIAamp微型離心柱中(不要潤濕離心柱邊緣)將離心柱放入2ml收集管中，蓋緊離心管蓋，以6000×g(8000rpm)離心1min。將離心柱取出，放入一支潔凈的2ml收集管中(試劑盒提供)。丟棄收集管及其中液體。

7)小心加入500μl Buffer AW1到QIAamp微型離心柱中(不要潤濕離心柱邊緣)。蓋緊離心管蓋，以6000×g(8000rpm)離心1min。將離心柱取出，放入一支潔凈的2ml收集管中(試劑盒提供)。丟棄收集管及其中液體。

8)小心加入500μl Buffer AW2到QIAamp微型離心柱中(不要潤濕離心柱邊緣)。蓋緊離心管蓋，以20000×g(14000rpm)離心3min。

9)將QIAamp微型離心柱置入一支新的2ml收集管中(自備)，丟棄收集管及其中液體。全速離心1min。

10)將QIAamp微型離心柱置入一支潔凈1.5ml收集管中(自備)，丟棄收集管及其中液體。小心在QIAamp微型離心柱中加入100μl Buffer AE或蒸餾水。室溫下(15-25℃)靜置1min，6000×g(8000rpm)離心1min。將收集管蓋好，保存于-20℃。

(2)試劑配置：按檢測人份數配置檢測體系PCR反應液各Xμl，每人份19μl分裝：

X＝19μl反應液×(n份標本+1份空白對照)

n為檢測標本數。

(3)加樣：在分裝好的PCR反應管中加入DNA，空白對照加等量生理鹽水或不加任何物質。加樣要求如下：

(4)擴增：檢測在常規PCR儀上進行，可用儀器包括ABI veriti(美國Applied Biosystems公司)等。反應條件如下：

PCR擴增體系試劑配制方法如下：

其中，引物序列為：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

(5)電泳：1.5％瓊脂糖凝膠電泳，110V，25min，凝膠成像系統觀察。

如圖2和圖3所示，即為引物擴增后所得產物的電泳圖譜。圖2中1-A為WRAP53-Exon1A-F和WRAP53-Exon1A-R引物擴增后的片段Exon1A，1-B為WRAP53-Exon1B-F和WRAP53-Exon1B-R引物擴增后的片段Exon1B，1-C為WRAP53-Exon1C-F和WRAP53-Exon1C-R引物擴增后的片段Exon1C，2為WRAP53-Exon2-F和WRAP53-Exon2-R引物擴增后的片段Exon2，以此類推，圖3中10為WRAP53-Exon10-F和WRAP53-Exon10-R引物擴增后的片段Exon10。通過電泳圖的分析表明本發明所述擴增有效，且條帶單一。

(6)Sanger測序：

取9μl PCR產物與2μl純化體系。按照以下程序進行純化：

將1μl純化產物分別與上、下測序引物按照如下體系進行混合：

測序反應程序：

沉淀環節：

向完成測序反應的產物中加入2μl 125mmol的EDTA，靜置5min；加入15：l無水乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心30min；倒置離心15sec，加入50μl l70％乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心15min；倒置離心15sec，置于95℃金屬浴上；加入10μl Hi-Di后進行變性試驗。變性程序：

變性程序結束后，上測序儀(ABI3730)測序。

(7)結果判斷：分別將測序結果與WRAP53基因參考序列(Genbankaccn：AC_000184.1)進行比對，根據實際突變情況對結果進行報告。

實施例3

為了驗證引物和整個檢測系統的可行性，取13例臨床樣本(每對引物設兩個重復，每組按引物編號為1-13)按實施例1和2的試劑和方法提取基因組、配制試劑、擴增和測序。取其中樣本4加入引物擴增，電泳結果如圖2和圖3所示，表明本發明所述引物對血液樣本能有效擴增，且條帶單一。測序結果如下表所示。

圖4顯示是樣本4的WRAP53第2號外顯子野生型正反測序截圖，說明測序結果峰值清晰無雜峰和重峰等影響結果的干擾。

從檢測結果可以看出，本發明所述引物已經把外顯子序列包括在內了，能夠擴展出WRAP53基因全部外顯子，并且測序結果完全準確。本發明所述引物可以準確的擴展出WRAP53基因全外顯子，通過結果表明本發明所述引物和方法及試劑盒能夠檢測出WRAP53基因所有外顯子。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州艾迪康醫學檢驗所有限公司

<120> 檢測先天性角化不良癥WRAP53基因的方法和引物

<130>

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtaaaacga cggccagtgg gaacgggaaa ccttctaa 38

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacagctatg accatggaca gcagtccgga gctaac 36

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtaaaacga cggccagtct aatctccgct gtgcttcc 38

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aacagctatg accatgtctt ctgcaggaag gcttgt 36

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtaaaacga cggccagtgg gacccagttt ctctctcc 38

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aacagctatg accatgctgg agaagtgggt ctcagg 36

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgtaaaacga cggccagtgt ggagtctggg gagatgaa 38

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacagctatg accatggggc atccctctcc tagaaa 36

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgtaaaacga cggccagtca gccctagccc tacacttg 38

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aacagctatg accatgtgct gccacaagaa attcac 36

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgtaaaacga cggccagttc tgagctcacc cttgaaca 38

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aacagctatg accatgctga ccagcccctc tgataa 36

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgtaaaacga cggccagtac acccagcctc atttttgt 38

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aacagctatg accatgggaa ggaaagggct gaaaac 36

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgtaaaacga cggccagttc atatctggga cgcattca 38

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aacagctatg accatggtac agaggacggc gtgaac 36

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgtaaaacga cggccagtgc ttgtgacaga cagcatgg 38

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aacagctatg accatgtctc agggtgtgac ccctac 36

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tgtaaaacga cggccagttc tgtatgcctg ggatgatg 38

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aacagctatg accatgattg gtggtcacct ctcgac 36

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tgtaaaacga cggccagtct gaaggagtgc ctggagac 38

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aacagctatg accatgaccc tacagctggg ctctg 35

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgtaaaacga cggccagtcc tctgccagca aatctctc 38

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aacagctatg accatgtctc tgtgggctca ggaaac 36

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tgtaaaacga cggccagtag agggagcaag tgtcctca 38

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aacagctatg accatggcct ggtttcagga ccaata 36

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 28

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aacagctatg accatg 16