本發明涉及植物基因工程領域，尤其涉及調控花青素合成與代謝的小麥新基因ThMYC4E。
背景技術：
：：藍粒小麥的糊粉層含有四種主要類型的花青素（Abdel-Aal,E.S.M.andP.Hucl,Compositionandstabilityofanthocyaninsinblue-grainedwheat.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2003.51(8):p.2174-2180）。花青素賦予植物器官和組織五顏六色，具有吸引昆蟲幫其傳粉的作用（Joaquin-Cruz,E.,etal.,Anthocyaninandphenoliccharacterization,chemicalcompositionandantioxidantactivityofchagalapoli(ArdisiacompressaK.)fruit:Atropicalsourceofnaturalpigments.FoodResearchInternational,2015.70:p.151-157），還具有幫助植物形成特異性抗病，保護植物抵御生物和非生物脅迫因素，免受紫外線的傷害的功能（Treutter,D.,Significanceofflavonoidsinplantresistance:areview.EnvironmentalChemistryLetters,2006.4(3):p.147-157），對人類健康也具有重要的作用，如其抗氧化、抗病毒、抗癌、抗衰老、增強人體免疫力等功效。含花青素的小麥品種是膳食來源的生活性物質（Bowen-Forbes,C.S.,Y.J.Zhang,andM.G.Nair,Anthocyanincontent,antioxidant,anti-inflammatoryandanticancerpropertiesofblackberryandraspberryfruits.JournalofFoodCompositionandAnalysis,2010.23(6):p.554-560；Wang,L.S.andG.D.Stoner,Anthocyaninsandtheirroleincancerprevention.CancerLetters,2008.269(2):p.281-290；Mazza,G.,Bioactivity,absorptionandmetabolismofAnthocyanins.Proceedingsofthe1stInternationalSymposiumonHumanHealthEffectsofFruitsandVegetables,2007(744):p.117-125）。在遺傳育種工作中，藍粒小麥的特點顯而易見，其可以運用于檢測隔離距離對遠交小麥品種的影響（Hanson,B.D.,etal.,Pollen-mediatedgeneflowfrombluealeuronewheattootherwheatcultivars.CropScience,2005.45(4):p.1610-1617），鑒定雜合子小麥（Zeven,A.C.,Wheatswithpurpleandbluegrains:areview.Euphytica,1991.56(3):p.243-258），以及在小麥染色體工程中檢測染色體的變化(Zheng,Q.,etal.,Utilizationofblue-grainedcharacterinwheatbreedingderivedfromThinopyrumpoticum.JournalofGeneticsandGenomics,2009.36(9):p.575-580)。4E染色體攜帶可育性基因，在育種工作中，可以建立4E-ms系，從而育成雜交小麥品種（Zhou,K.,etal.,The4E-SystemofProducingHybridWheat.CropScience,2006.46(1):p.250-255）。有關小麥的藍粒性狀，起初是從偃麥草、山羊草、黑麥、大麥中發現的（Zhengetal.2009）。其中，與藍粒小麥性狀相關的主效基因Ba1定位于長穗偃麥草（2n=10x=70,genomeEStEStEStEStEeEeEeEeEeEe）(Zeven,A.C.,Wheatswithpurpleandbluegrains:areview.Euphytica,1991.56(3):p.243-258；Zheng,Q.,etal.,Utilizationofblue-grainedcharacterinwheatbreedingderivedfromThinopyrumpoticum.JournalofGeneticsandGenomics,2009.36(9):p.575-580）。細胞遺傳學分析確定了深藍色和藍粒58的4D染色體被長穗偃麥草的一對染色體所代替，從而推測出，源于第四同源群的與藍粒小麥性狀相關的主效基因定位于長穗偃麥草。源于長穗偃麥草的藍粒基因被命名為Ba1（Dubcovsky,J.,etal.,Geneticmapofdiploidwheat,TriticummonococcumL.,anditscomparisonwithmapsofHordeumvulgareL.Genetics,1996.143(2):p.983-999），并將其定位于4Ag染色體常臂FL0.71–0.80處，通過染色體異位賦予種子不同的籽粒顏色（Zheng,Q.,etal.,Molecularcytogeneticcharacterizationofwheat-Thinopyrumponticumtranslocationsbearingblue-grainedgene(s)inducedbyr-ray.Euphytica,2006.152(1):p.51-60）。由藍粒和白粒小麥雜交的F2代群體中(MetzgerandSebesta2004)，藍白粒基因的分離率為3:1，表明Ba1是一個顯性基因，Ba1對非藍色等位基因是不完全顯性。一粒小麥，偃麥草中與Ba1同源的基因分別位于4A，4J染色體上(Dubcovskyetal.1996;Singhetal.2007)。花青素生物合成是由一個復雜的次生代謝途徑來完成的，屬于類黃酮次生代謝途徑的一個分支，從苯丙氨酸開始經羥基化、糖基化、甲基化、酰基化修飾后轉運富集至液泡儲存。同時它也是一系列酶促反應的結果，主要包括8種結構酶基因：查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構酶(CHI)、類黃酮-3-羥化酶(F3H)、類黃酮-3'-羥化酶(F3'H)、類黃酮-3',5'-羥化酶(F3'5'H)、二羥基黃酮醇還原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)、類黃酮3-O-葡糖苷轉移酶(UFGT)（Saito,K.,etal.,TheflavonoidbiosyntheticpathwayinArabidopsis:structuralandgeneticdiversity.PlantPhysiologyandBiochemistry,2013.72:p.21-34；Zhang,Y.,E.Butelli,andC.Martin,Engineeringanthocyaninbiosynthesisinplants.Currentopinioninplantbiology,2014.19:p.81-90；Ishiguro,K.,etal.Geneticengineeringoffloriculturalcrops:modificationofflowercolour,floweringandshape.inXXIVInternationalEucarpiaSymposiumSectionOrnamentals:OrnamentalBreedingWorldwide953.2012）。目前，小麥花青素合成途徑中有關查耳酮合酶，二氫黃酮醇4-還原酶等上調基因已經被克隆(Yangetal.2004;Yangetal.2003)。但這些基因表達模式之間的相關性以及對種子籽粒的顏色卻鮮有研究。花青素代謝途徑是一個次級代謝，其過程不會影響植物的生長發育。花青素合成中，主要的結構基因編碼苯丙氨酸氨裂解酶、查耳酮合酶、查耳酮異構酶等(DunlopandCurtis1991)。這些結構基因主要由兩種類型的轉錄因子調控：bHLH，Myb(Ishiguroetal.2012;Xuetal.2015)。其中任何反應環節受阻，都會導致植物表型缺失。隨著高通量RNA測序技術的發展，可以為轉錄組分析提供有效的技術手段（Dornetal.2013;Fironetal.2013;Zhangetal.2014），從而獲得轉錄組中核苷酸序列的基因表達信息。本專利中，采用RNA測序技術對藍粒和白粒小麥花青素合成途徑中，結構基因和轉錄因子的比較轉錄組分析，分離出在藍粒小麥中具有較高轉錄水平的一類bHLH轉錄因子ThMYC4E，作為控制藍粒性狀的Ba1的候選基因，其功能已得到驗證。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是提供一種調控花青素合成與代謝的小麥新基因ThMYC4E。為解決上述問題，本發明所述的調控花青素合成與代謝的小麥新基因ThMYC4E，其特征在于：該基因ThMYC4E具有序列表中SEQIDNO.1第1位到1707位所示的核苷酸序列。所述基因所編碼的蛋白具有序列表中SEQIDNO.2第1位到568位所示的氨基酸序列。所述基因作為重組載體或宿主細胞中的一部分。所述重組載體作為宿主細胞中的一部分。所述宿主細胞是指除人或動物的生殖細胞或胚胎干細胞以外的細胞。所述基因通過特異性引物ThMYC4EspF和ThMYC4EspR從小麥品種中篩選而得。如上所述的調控花青素合成與代謝的小麥新基因ThMYC4E在轉化植物獲得轉基因植物中的應用，其特征在于：構建該ThMYC4E植物表達載體，并利用該表達載體轉化植物細胞，進而培育成轉基因植株。如上所述的調控花青素合成與代謝的小麥新基因ThMYC4E在調控花青素合成中的應用，其特征在于：所述基因與具有序列表中SEQIDNO.3第1位到644位所示的核苷酸序列的ZmC1基因共轉染到植物中，使所述基因與所述ZmC1基因進行表達。如上所述的調控花青素合成與代謝的小麥新基因ThMYC4E在調控花青素合成中的應用，其特征在于：所述基因所編碼的蛋白與具有序列表中SEQIDNO.3第1位到644位所示的核苷酸序列的ZmC1基因共轉染到植物中，使所述基因與所述ZmC1基因進行表達。本發明與現有技術相比具有以下優點：1、與藍粒小麥性狀相關的主效基因定位于長穗偃麥草（2n=10x=70,genomeEStEStEStEStEeEeEeEeEeEe）。細胞遺傳學分析確定了深藍色和藍粒58的4D染色體被長穗偃麥草的一對染色體所代替，從而推測出，源于第四同源群的與藍粒小麥性狀相關的主效基因位于長穗偃麥草。Ba1對非藍色等位基因是不完全顯性。本發明以Tubulin-F和Tubulin-R為引物擴增的微管蛋白基因為cDNA模板量作為規范，用引物ThMYC4E-F和ThMYC4E-R對本發明中ThMYC4E編碼區表達水平在藍粒和白粒小麥中進行檢測，在藍粒小麥中可以檢測到ThMYC4E，然而在白粒小麥中卻檢測不到ThMYC4E。經過序列比對，檢測到的ThMYC4E序列與轉錄組分析的序列結果一致。通過比較藍粒不同組織中，ThMYC4E的表達水平，發現種子，胚芽鞘，穎殼中均有ThMYC4E的表達，這表明，ThMYC4E在種子和胚芽鞘中的表達可能與它調控花青素的合成有關，然而，ThMYC4E在穎殼中表達所起到的功能還有待進一步研究證明。在根、莖、葉中檢測不到ThMYC4E的表達（參見圖2）。因此，ThMYC4E具有調控花青素合成的功能，可以實現在具體轉基因植物中的應用。2、通過將本發明中ThMYC4E的目的基因片段連接到PGEM–Teasy載體中，并轉入大腸桿菌DH5α中，克隆到帶有目標基因的重組質粒。設計帶有ATTB接頭的引物ThMYC4EPromoter-F和ThMYC4EPromoter-F，利用Gateway技術將上述目標基因轉入到終載體pBract214中，構成瞬時表達載體pBract214：ThMYC4E。利用基因槍轟擊進入Opata的胚芽鞘中。光處理兩天后，在體視顯微鏡下觀察這些胚芽鞘細胞合成的紅色花青素斑點。3、本發明中的ThMYC4E不存在于烏拉爾圖小麥，一粒小麥，圓錐小麥，節節麥中和普通小麥中。在進化關系上，ThMYC4E與來源于烏拉爾圖小麥和節節麥的Bhlh蛋白進化關系較遠。可以利用特異性引物ThMYC4EspF和ThMYC4EspR，作為4E染色體和其他藍粒小麥品種中ThMYC4E的篩選標記。4、本發明中的bHLH轉錄因子ThMYC4E，通過與ZmC1互作，可以誘導Opata的胚芽鞘合成花青素。說明ThMYC4E在植物花青素的合成途徑中發揮著重要的作用。附圖說明下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細的說明。圖1為本發明花青素合成途徑中結構基因的差異表達及該途徑中的轉錄因子。其中：箭頭標明代謝過程途徑，縮寫字母代表催化這一過程的關鍵酶基因。圓括號中第一個數字代表功能基因的總數，第二個數字代表控制藍粒小麥性狀的上調基因，第三個數字代表位于普通小麥四號染色體上的功能基因。圖2為本發明ThMYC4E的相對表達水平。其中：A表示ThMYC4E‘在Blue1’,‘Blue2’,‘White1’and‘White2’小麥中的表達水平；B表示ThMYC4E在‘Blue1’的根，葉，莖，種子，穎殼，胚芽鞘中等組織器官中的表達水平。圖3為本發明玉米和水稻中，調控花青素合成代謝的ThMYC4E和bHLH類轉錄因子氨基酸序列比對。其中：黑線表示bHLH-MYC_N端保守域（與MYB蛋白轉錄因子相互作用），HLH域（促進DNA的結合）和ACT-like結構域（與DNA聚合酶相互作用，促使轉錄起始作用）。圖4為本發明基因槍轟擊opata胚芽鞘，光照培養48小時后驗證ThMYC4E的功能。其中：ZmC1,ZmR和ThMYC4E分別代表構建的質粒載體pBract214:ZmC1,pBract214:ZmR和pBract214:ThMYC4E。圖5為本發明ThMYC4E在近等基因系以及其它自然群體中的分布。其中：A中1-8分別代表‘Blue1’,‘Blue2’,‘White1’,‘White2’,‘BlueNorco’,‘SebestaBlue1’,‘SebestaBlue2’和‘SebestaBlue3’,B中1-12代‘i:Jimai22藍粒’表近等基因系，13-15代表‘Jimai22’三次重復擴增。圖6為本發明藍粒和白粒中基因的差異表達。分為三種類型的基因：紅色代表上調基因；綠色代表下調基因；藍色代表基因的差異表達。X軸表示右邊樣本的表達水平；Y軸表示左邊樣本的表達水平。具體實施方式實施例1調控花青素合成與代謝的小麥新基因ThMYC4E，該基因ThMYC4E具有序列表中SEQIDNO.1第1位到1707位所示的核苷酸序列。其通過特異性引物ThMYC4EspF和ThMYC4EspR從小麥品種中篩選而得。調控花青素合成與代謝的小麥新基因ThMYC4E所編碼的蛋白具有序列表中SEQIDNO.2第1位到568位所示的氨基酸序列。一、ThMYC4E基因的分離1、DNA和總RNA的提取：DNA從1克10天大的幼苗分離出（采用YanZH,WanYF,LiuKF,ZhengYL,WangDW，（2002)IdentificationofanovelHMWgluteninsubunitandcomparisonofitsaminoacidsequencewiththoseofhomologoussubunits.ChineseScienceBulletin47:220-225的方法）。總RNA從十顆藍粒種子的糊粉層提取采用TiangenRNAprep植物提純試劑盒(Tiangen公司,北京)。cDNA從總RNA中獲得采用ThermoRevertAidFirstStrandcDNA合成試劑盒(Thermo-FisherScientific,中國上海)。2、設計引物分離ThMYC4E的編碼區：基于bHLH轉錄因子編碼區序列轉錄本分析，設計引物從藍粒cDNA中分離出TaMYC4E基因。引物的設計使用Primer5軟件(PremierBiosoft,PaloAlto,加拿大)（參見表1）。表1為本發明所使用的引物名稱和序列3、鑒定ThMYC4E在染色體上的位置：近等基因系‘i:Jimai22藍粒’是由‘Jimai22’和‘Blue58’經過6次回交和5次自交成生的后代品種。Blue58的一對染色體被來源于長穗偃麥草的一對4E染色體所替換(Zhengetal.2009)。本實驗中（參見表2），共使用了不具藍粒性狀的72個青海育成品種來驗證ThMYC4E不存在于A組,AB組和ABD組小麥的基因組中。采用4個具有藍色性狀的小麥品種，驗證了ThMYC4E普遍存在于含有4E染色體的小麥品種中（參見表2）。特異性ThMYC4EspFThMYC4EspR引物可作為ThMYC4E基因在普通小麥中的篩選標記（參見圖5）。圖5展示了ThMYC4E在近等基因系以及其它自然群體中的分布。A中1-8分別代表‘Blue1’,‘Blue2’,‘White1’,‘White2’,‘BlueNorco’,‘SebestaBlue1’,‘SebestaBlue2’和‘SebestaBlue3’,B中1-12代‘i:Jimai22藍粒’表近等基因系，13-15代表‘Jimai22’三次重復擴增。表2為本發明所使用材料的表型和基因型4、PCR擴增得到目的序列：PCR擴增利用PCR儀GeneAmpPCRSystem9700（Thermo-FisherScientific，中國上海），使用高保真酶high-fidelityPhushionDNApolymerase（Thermo-FisherScientific，中國上海），經過以下幾步完成：預變性98℃2min；35個循環：98℃15s，61℃30s，72℃30s；72℃延伸5min。反應結束后，用1%的瓊脂糖凝膠檢測PCR產物ThMYC4E編碼區。5、PCR產物回收：PCR產物經過1%的瓊脂糖凝膠電泳用TiangenTIANgelMidi純化試劑盒(Tiangen)得到膠回收產物。6、目的基因的克隆：將上述膠回收產物克隆至pGEM-TEasy質粒載體(PromegaCorporation,Madison,Wisconsin,USA)得到重組質粒，重組質粒轉化至大腸桿菌DH5α中，挑取6個陽性克隆送至華大基因進行測序，提取質粒備用（使用TIANpureMiniPlasmidKit(Tiangen)試劑盒）。二、藍粒和白粒小麥的比較轉錄組分析按照測序公司mRNA-Seq制備樣本要求，構建藍粒和白粒小麥糊粉層的cDNA文庫(Illumina,Inc.,SanDiego,CA,USA)。采用雙末端測序技術測序（北京，中國）。在組裝拼接序列之前，將經測序儀讀取的未處理過的序列進行篩選，從而獲得高質量的可信序列。經過精確的序列篩選后，利用參數值將高質量的讀取序列拼接，構建新的一致序列(Grabherretal.2013）。通過表達量來計算功能基因的表達水平。采用軟件IDEG6，卡方檢驗分析藍粒和白粒糊粉層中功能基因的差異表達(Romualdietal.2003)。運用BLASTX將搜集到花青素生物合成途徑中有關的功能基因與經轉錄組測序的藍色和白色的混合糊粉進行序列比對。經過精細的序列篩選后，從白粒中獲得34.59M測定的序列，從藍粒中獲得23.48M測定序列，可信序列分別占98.16%和83.94%（參見表3）。高質量的可信序列經過比對后，使用Trinity軟件拼接組裝出73728個功能基因（參見表4）。基于表達量計算值的基礎，確定出藍粒和白粒功能基因的差異表達水平。通過差異表達水平的比較，在藍粒和白粒中，共有5828個差異表達的功能基因（參見圖6）。以白粒作為參考對照，鑒定出4176個上調功能基因和1652個下調功能基因在藍粒中的表達水平。表3為本發明中的轉錄組測序數據表4為本發明組裝的功能基因為了進一步確定控制藍粒性狀的關鍵基因，將有關花青素生物合成途徑中的11個結構基因和兩個轉錄因子在組裝結構基因數據庫中進行BLAST搜索。發現77個功能基因與花青素合成途徑中的基因具有同源性。其中，8個功能基因在藍粒中的轉錄表達水平高于在白粒中的表達量。這8個功能基因與一個苯丙氨酸氨裂解酶,一個類黃酮3',5'羥化酶，一個二氫黃酮醇還原酶，和五個bHLH轉錄因子有關（參加圖1；表5）。這五個bHLH轉錄因子均來自于CL3336.片段。在白粒小麥中，這五個轉錄因子的轉錄水平相當低，表達量小于0.29，然而，在藍粒中表達量可達19.14，這表明在白粒小麥中，這個基因不表達。這個編碼bHLH轉錄因子的基因被命名為ThMYC4E，可以作為Ba1基因的候選基因。表5為糊粉層中與花青素合成有關的結構基因圖6展示了藍粒和白粒中基因的差異表達。三、ThMYC4E生物信息學分析使用VectorNTI10軟件（Invitrogen）進行序列拼接及比對。利用Primer5.0（PremierBiosoft,PaloAlto,加拿大）軟件進行引物設計。(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiPROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)網站被用來預測保守功能。預測保守功能域。使用MEGA4.0構建bHLH蛋白的系統進化樹(Tamuraketal.,2007)。為了解ThMYC4E與其它同類基因的關系，從而預測ThMYC4E的生物學功能，對ThMYC4E進行生物信息學分析。我們選擇了已知能夠調控花青素合成的bHLH類轉錄因子的蛋白全長序列構建系統發生樹。從同源性來看，在玉米和水稻中ThMYC4E與調控花青素合成代謝的bHLH類蛋白有較近的關系。bHLH蛋白在相同的聚群中劃分在同一分支，而ThMYC4E在玉米，小麥和水稻中的聚類情況相對獨立，這表明ThMYC4E并非來源于普通小麥的染色體。ThMYC4E蛋白與bHLH功能蛋白相比，包含的三個完整的結構域：bHLH-MYC_N末端,HLH和ACT-like域結構（參見圖3）。圖3展示了在玉米和水稻中，調控花青素合成代謝的ThMYC4E和bHLH類轉錄因子氨基酸序列比對。黑線表示bHLH-MYC_N端保守域（與MYB蛋白轉錄因子相互作用），HLH域（促進DNA的結合）和ACT-like結構域（與DNA聚合酶相互作用，促使轉錄起始作用）。四、ThMYC4E的表達譜反轉錄PCR(RT-PCR)以Tubulin-F和Tubulin-R為引物擴增的微管蛋白基因為cDNA模板量作為規范，用引物ThMYC4EcdsF和ThMYC4EcdsR對ThMYC4E的表達水平進行檢測。ThMYC4E編碼區全長1707bp，編碼588個氨基酸。在種子，胚芽鞘，穎殼中均有ThMYC4E的表達，這表明，ThMYC4E在種子和胚芽鞘中的表達可能與它調控花青素的合成有關，然而，ThMYC4E在穎殼中表達所起到的功能還有待進一步研究證明。在根、莖、葉中卻檢測不到ThMYC4E的表達(參見圖2)。圖2展示了ThMYC4E的相對表達水平。A表示ThMYC4E‘在Blue1’,‘Blue2’,‘White1’and‘White2’小麥中的表達水平；B表示ThMYC4E在‘Blue1’的根，葉，莖，種子，穎殼，胚芽鞘中等組織器官中的表達水平。五、ThMYC4基因調控花青素合成的轉錄活性功能驗證1、Gateway技術設計帶有ATTB接頭的引物TaMYC1AttB1F和TaMYC1AttB2R從連接有全長ThMYC4E編碼區的pGEM-TEasy載體上擴增；然后以該PCR產物為DNA模板，使用attB1adapter和attB2adapter進行PCR擴增；擴增產物進行瓊脂糖電泳、回收、測定濃度。根據Gateway克隆試劑盒說明書進行BP反應構建入門載體pDONR207-ThMYC4E，步驟如下：⑴BP反應：200~400ngPCR回收產物100ngpDONR207載體1μlBPClonaseⅡ加水至5μl25℃水浴12~16h⑵向反應體系中加入0.5μlProteinaseK(2μg/μl)，37℃水浴15min。⑶將重組質粒轉化進DH5α，陽性克隆篩選并測序，然后提取質粒備用（TIANpureMiniPlasmidKit(Tiangen)試劑盒）。⑷瞬時表達載體的構建：本發明所用瞬時表達載體pBRACT214:ThMYC4E，pBRACT214:ZmR和pBRACT214:ZmC1，已經過Gateway改造。根據Gateway克隆試劑盒說明書進行LR反應構建瞬時表達載體，步驟如下：①LR反應：300ngpDONR207-重組質粒100ng瞬時表達載體1μlLRClonaseⅡ加水至5μl25℃水浴12~16h②向反應體系中加入0.5μlProteinaseK(2μg/μl)，37℃水浴15min。③將重組質粒轉化進DH5α，陽性克隆篩選并測序，然后提取質粒備用。2、基因的功能驗證瞬時表達載體重組載體使用AhmedN,MaekawaM,UtsugiS,HimiE,AbletH,RikiishiK,NodaK(2003)TransientexpressionofanthocyaninindevelopingwheatColeoptilebymaizeC1andbeta-peruregulatorygenesforanthocyaninsynthesis.BreedingScience方法，利用基因槍轟擊進入Opata的胚芽鞘中。兩天后使用實體顯微鏡對所有被處理過的胚芽鞘(LeicaCo.,OskarBarnackGermany)進行觀察拍照（參見圖4）。胚芽鞘紅細胞數量進行統計并保存在MicrosoftExcel2003中（參見表6）。表6基因槍轟擊之后胚芽鞘紅細胞數量注：BCN，轟擊的胚芽鞘數量；RCN，胚芽紅細胞鞘數量；ADCNEC，平均每個胚芽鞘上的紅細胞數量；SD，標準差；MaxiRCNEC，單個胚芽鞘紅細胞最大數；MiniRCNEC，單個胚芽鞘紅細胞最小數。圖4展示了基因槍轟擊opata胚芽鞘，48小時后驗證ThMYC4E的功能。實施例2調控花青素合成與代謝的小麥新基因ThMYC4E作為重組載體，該重組載體作為宿主細胞中的一部分。實施例3調控花青素合成與代謝的小麥新基因ThMYC4E作為宿主細胞中的一部分。上述實施例2~3中的宿主細胞是指除人或動物的生殖細胞或胚胎干細胞以外的細胞。實施例4調控花青素合成與代謝的小麥新基因ThMYC4E在轉化植物獲得轉基因植物中的應用是指：構建該ThMYC4E植物表達載體，并利用該表達載體轉化植物細胞，進而培育成轉基因植株。實施例5調控花青素合成與代謝的小麥新基因ThMYC4E在調控花青素合成中的應用是指：該基因與具有序列表中SEQIDNO.3第1位到644位所示的核苷酸序列的ZmC1基因共轉染到植物中，使基因與ZmC1基因進行表達。實施例6調控花青素合成與代謝的小麥新基因ThMYC4E在調控花青素合成中的應用是指：該基因所編碼的蛋白與具有序列表中SEQIDNO.3第1位到644位所示的核苷酸序列的ZmC1基因共轉染到植物中，使基因與ZmC1基因進行表達。<110>中國科學院西北高原生物研究所<120>調控花青素合成與代謝的小麥新基因ThMYC4E<160>2<210>1<211>1707<212>DNA1ATGCGGGAAATAGCTACTCAGCGGTGTGGTAATCGATCAATGGCGCTATC51AGCTCCTCCCAGTCAGGAACAGCCGTCGGGGAAGCAATTCGGCTACCAGC101TCGCTGCTGCTGTGAGGAGCATCAACTGGACTTATGGCATATTTTGGTCC151ATTTCCGCCAGCCCGCGCCCAGGCCACTCCTCAGTTCTGGCGTGGAAGGA201TGGGTTCTACAACGGCGAGATAAAGACTAGAAAGATTACCGGCTCGACCA251CTACGGAGCTTACAGCGGACGAGCGCGTCATGCACAGAAGCAAGCAACTG301AGGGAGCTCTACGAATCGCTCTTGCCCGGCAACTCCAACAACCGGGCAAG351GCGACCAACCGCCTCACTGTCACCGGAGGATCTCGGGGACGGCGAGTGGT401ATTACACCATAAGCATGACTTACACCTTCCACCCTAATCAAGGGTTGCCA451GGCAAAAGCTTTGCGAGCAATCAACATGTTTGGCTGTACAACGCTCAATA501CGCAAACACCAGAGTTTTCCCCCGCGCGCTCTTAGCAAAGACAATCGTTT551GCATTCCCTTCATGGGCGGTGTGCTTGAGCTCGGAACGTCGGATCAGGTG601TTGGAGGACCCGAGCATGGTGAAGCGGATCAGCACGTCTTTCTGGGAGCT651GCACTTGCCGTCATCCTTGGAGTCGAAGGATCCGAGCTCCAGCACATCAG701CAAACGATACCAGGGAGGCCACCGACATCATCTTGTTCGAGGATTTCGAC751CACAACGACACAGTTGAGGGGGTGATCTCTGAGCAAAGGGAGGTCCAGTG801CCCGTCCAACGTCAATCTGGAGCGCCTCACAAAGCAGATGGACGAGTTCC851ACAGCCTTCTCGGTGGACTGGACGTGCATCCTCTCGAAGACAGATGGATC901ATGGACGAGCCCTTTGAGTTTACGTTTTCCCCAGAAGTGGCGCCGGCTAT951GGATATGCCGAGCACCGACGATGTCATCGTCACTTTAAGTAGGTCCGAAG1001GCTCTCGTCCATCCTGCTTCACAGCGTGGAAGGGATCATCCGAGTCGAAA1051TACGTGGCTGGCCAGGTCGTTGGGGAGTCACAGAAGTTGCTGAATAAAGT1101TGTGGCTGGTGGTGCATGGGCGAGCAATTATGGCGGTCGCACCATGGTGA1151GAGCTCAGGGAATTAACAGCAACACCCATGTCATGACAGAGAGAAGACGC1201CGGGAGAAACTCAACGAGATGTTCCTGGTTCTCAAGTCACTGGTCCCGTC1251CATTCACAAGGTAGACAAAGCATCCATCCTCACAGAAACGATAGGTTATC1301TTAGAGAACTGAAGCAAAGGGTAGATCAGCTAGAATCCAGCCGGTCACCG1351TCTCACCCAAAAGAAACAACAGGACCGAGCAGAAGCCATGTCGTCGGCGC1401TAGGAAGAAGATAGTCTCGGCCGGATCCAAGAGGAAGGCGCCAGGGCTGG1451AGAGCCCGAGCAATGTCGTGAACGTGACGATGCTGGACAAGGTGGTGCTG1501TTGGAGGTGCAGTGCCCGTGGAAGGAGCTGCTGATGACACAAGTGTTTGA1551CGCCATCAAGAGCCTCTGTCTGGACGTTGTCTCCGTGCAGGCATCCACAT1601CAGGTGGCCGTCTTGACCTCAAGATACGAGCTAATCAGCAGCTTGCGGTC1651GGTTCTGCTATGGTGGCACCTGGGGCAATCACCGAAACACTTCAGAAAGC1701TATATAG<210>2<211>568<212>DNA1MREIATQRCGNRSMALSAPPSQEQPSGKQFGYQLAAAVRSINWTYGIFWS51ISASPRPGHSSVLAWKDGFYNGEIKTRKITGSTTTELTADERVMHRSKQL101RELYESLLPGNSNNRARRPTASLSPEDLGDGEWYYTISMTYTFHPNQGLP151GKSFASNQHVWLYNAQYANTRVFPRALLAKTIVCIPFMGGVLELGTSDQV201LEDPSMVKRISTSFWELHLPSSLESKDPSSSTSANDTREATDIILFEDFD251HNDTVEGVISEQREVQCPSNVNLERLTKQMDEFHSLLGGLDVHPLEDRWI301MDEPFEFTFSPEVAPAMDMPSTDDVIVTLSRSEGSRPSCFTAWKGSSESK351YVAGQVVGESQKLLNKVVAGGAWASNYGGRTMVRAQGINSNTHVMTERRR401REKLNEMFLVLKSLVPSIHKVDKASILTETIGYLRELKQRVDQLESSRSP451SHPKETTGPSRSHVVGARKKIVSAGSKRKAPGLESPSNVVNVTMLDKVVL501LEVQCPWKELLMTQVFDAIKSLCLDVVSVQASTSGGRLDLKIRANQQLAV551GSAMVAPGAITETLQKAI<210>3<211>644<212>DNA1ATGGCGAAGGCAGATGGAAGGAAGTCCCCCTCAAAGCCGGTCTGCGGCGG51TGCGGCAAGAGCTGCCGGCTGCGGTGGCTCAACTACCTCCGGCCGAGCAT101CAAGCGGGGCAACATCTCCGACGACGACGAGGAGCTCATCGTCAGGCTCC151ACCGCCTCCTCGGCAACAGGTGGTCCCTCATCGCGGGCAGGCTGCCCGGC201CGAACAGACAACGAAATCAAGAACTACTGGAACAGCACCCTTGGCCGGAA251GGCGCTCCCGGCGCGACTGGACACCACCAGGACGGTCGCCACACCCTGCC301CCTCCGCCAGCTCCGGCTCCTCCACCCGGGGCGTCGACAGCATGGCTTTC351CTCTAACTGCGGGGATGGTACAAGTGCCAAGGCTGCGGGGCTGCTGTCGT401CGGCCTCGGTGTGGGTGCCCAAGCCCGTGAGGTGCACAGGCGGTCTCTTC451CTCAGCCGGGATGCGCCGCCCCCGCCGGTCATGGAGACGCGGGCCGTGGG501AGGAGACGCAGATGAGTGCAGCGGCAGCAGCTTGGTGGCATCGTCGGGCG551GTGGCGACTGGATGGACGACGTAAGAGCCTTAGCGTCGTTTCTCGAGTCC601GACGAGGACTGGGACTGGGTCAAGTCCCTGCAGATGGCGTATAA當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3