本實用新型涉及酶的固定化領域，具體為一種麥麩酯酶測定裝置及其制備裝置。本實用新型的麥麩酯酶測定裝置能夠用于農藥殘留的檢測，且具有較高的酶活回收率，具有較好的應用前景。

背景技術：

麥麩酯酶作為植物酯酶(plant esterase,PE)中的一種，屬于羧酸酯水解酶類。由于麥麩酯酶的活性能被有機磷和氨基甲酸酯類農藥所抑制，因而其可用于快速測定果蔬中有機磷農藥和氨基甲酸酯農藥的殘留。與化學催化劑相比，麥麩酯酶作為一類具有催化功能的蛋白質，其具有反應速度快、反應條件溫和、底物專一性強，可在水溶液和中性pH下操作等優點。但其也存在一些不足，如酶一旦從細胞中分離出來，其活性會迅速下降；由于酶是溶于水的，在水溶液中進行反應，會導致酶和底物、產物從水中分離困難，不利于循環使用。

固定化技術的出現徹底解決了前述問題，不僅提高了酶的活性，而且還實現了酶的可重復使用性。酶的固定化一般是指將水溶性的酶固定在水不溶性載體上，使其依然具有催化活性并可回收和重復使用的不溶于水的酶的衍生物。其方法可初步歸納為四類，即吸附、結合、包埋和交聯；這些原始方法組合已經形成了數百種方法。

目前，對于麥麩酯酶的固定化主要集中于交聯法和吸附法。其中，交聯法反應較劇烈，常常引起酶蛋白的高級結構發生變化，并導致活性中心受到破壞，從而難于保證每次都能制得高活力的樣品。吸附法具有操作簡便，條件溫和，不會引起酶的變異失活，且載體價廉易得，可反復使用等優點，被越來越多的學者所采用?，F有麥麩酯酶的吸附固定通常選用交換樹脂、濾紙等作為吸附載體，吸附效率較低。

為此，迫切需要一種新的裝置，以解決上述問題。

技術實現要素：

本實用新型的發明目的在于：針對現有麥麩酯酶的吸附固定通常選用交換樹脂、濾紙作為吸附載體，載體單一，酶活回收率較低的問題，提供一種麥麩酯酶測定裝置及其制備裝置。本實用新型打破了現有傳統的麥麩酯酶采用樹脂、濾紙吸附固定化的方式，具有設計合理，結構簡單，體積小，重量輕，便于攜帶，酶活回收率高等優點。本實用新型能夠用于果蔬中有機磷農藥和氨基甲酸酯農藥殘留的檢測及相關研究，測定結果準確、可靠、精度高，能夠滿足工業化、大規模應用的需求，具有較好的應用前景。

為了實現上述目的，本實用新型采用如下技術方案：

一種麥麩酯酶測定裝置，包括固定化載體膜、設置在固定化載體膜上的麥麩酯酶層，所述固定化載體膜為玻璃纖維素膜，所述固定化載體膜為圓形、橢圓形或多邊形。

所述麥麩酯酶層是將麥麩酯酶酶液吸附于固定化載體膜上，然后通過干燥，形成的麥麩酯酶層。

所述固定化載體膜為矩形。

所述固定化載體膜的長、寬分別為0.1～5cm、0.1～5cm。

所述固定化載體膜的規格為1cm×1cm。

用于前述裝置的制備裝置，包括：

盛放容器，其用于盛放麥麩酯酶酶液，并提供反應空間；

固定化載體膜，其用作麥麩酯酶的載體，并被放置于盛放容器內；

干燥設備，其用于對吸附麥麩酯酶酶液的固定化載體膜進行干燥。

所述盛放容器為燒杯。

所述固定化載體膜為玻璃纖維素膜。

所述干燥設備為干燥板，吸附麥麩酯酶酶液的固定化載體膜經水洗去表面殘渣后能在干燥板上自然晾干。

所述干燥設備包括玻璃板、超凈工作臺，吸附麥麩酯酶酶液的固定化載體膜經水洗去表面殘渣后能置于玻璃板上，所述超凈工作臺的排風扇能對玻璃板上的固定化載體膜進行排風干燥。

還包括恒溫加熱裝置，其能夠對盛放容器中的麥麩酯酶酶液進行恒溫加熱。

針對前述問題，本實用新型提供一種麥麩酯酶測定裝置及其制備裝置。針對現有麥麩酯酶的吸附固定通常選用交換樹脂、濾紙作為吸附載體，回收率較低的問題，本實用新型提供一種新的麥麩酯酶測定裝置，其包括固定化載體膜、設置在固定化載體膜上的麥麩酯酶層，固定化載體膜為玻璃纖維素膜，固定化載體膜為圓形、橢圓形、多邊形。其中，麥麩酯酶層是將麥麩酯酶酶液吸附于固定化載體膜上，然后通過干燥，形成的麥麩酯酶層。本實用新型中，以玻璃纖維素膜作為載體，然后將麥麩酯酶酶液吸附于固定化載體膜上，然后通過干燥，在玻璃纖維素膜表面形成麥麩酯酶層。本實用新型的玻璃纖維素膜呈化學惰性，具有較多的毛細纖維結構，能吸附比同等纖維素膜更多的水分，流速快，耐高溫，可用于細微顆粒的采集，且不含有粘合劑；而本實用新型的測定裝置能將酶吸附于玻璃纖維素膜上，且保留較高的活性，同時不需要單獨的粘合劑，有效保證測定裝置的活性。經過實際驗證，本實用新型切實可行，能夠用于果蔬中有機磷農藥和氨基甲酸酯農藥殘留的檢測，具有較好的效果。同時，本實用新型具有較高的吸附效率，應用前景較好。

作為優選，固定化載體膜為矩形。

進一步，本實用新型提供用于前述測定裝置的制備裝置，其包括盛放容器、固定化載體膜、干燥設備。其中，盛放容器用于盛放麥麩酯酶酶液，并提供反應空間；玻璃纖維素膜浸潤于麥麩酯酶酶液中；麥麩酯酶液可以為麥麩酯酶粗提酶液用0.2mol/L pH值為7.0的磷酸氫鈉鹽緩沖液稀釋4倍的酶液；干燥設備則用于對吸附麥麩酯酶酶液的固定化載體膜進行干燥。

本實用新型的制備裝置工作時，酶液盛放于盛放容器中，將玻璃纖維素膜浸潤于該酶液中，再將盛放容器置于水浴鍋中29℃恒溫靜置水浴4h；然后，將處理后的玻璃纖維素膜片用超純水洗去表面殘渣，室溫晾干備用，即得測定裝置。

作為優選，干燥設備包括盛放膜片的玻璃板、超凈工作臺。將處理后的玻璃纖維素膜片置于玻璃板上，再將玻璃板置于超凈工作臺內，打開排風扇將膜片干燥，即得測定裝置。

本實用新型將麥麩酯酶吸附固定于玻璃纖維素膜片上，同時不破壞麥麩酯酶的活性構象中心，固定化酶能保存較長的時間，且具有較高的酶活性，適用于酶抑制法快速檢測農藥殘留的相關研究。同時，本實用新型的制備簡單、操作方便，固定化方式柔和，對酶活的破壞程度較小，效率高。本實用新型技術方案設計合理，簡單有效，打破了現有傳統的麥麩酯酶采用樹脂吸附固定化的方式，具有廣闊的應用前景，值得大規模推廣和應用。

綜上所述，由于采用了上述技術方案，本實用新型的有益效果是：

(1)本實用新型以麥麩酯酶為酶源，設計簡單，生產成本低廉；

(2)麥麩酯酶可選用0.2mol/LpH7.0磷酸氫鹽緩沖液稀釋4倍，酶液體系較穩定；

(3)本實用新型以玻璃纖維素膜為載體吸附，操作簡便，對酶的活性中心破壞較小，所制備的測定裝置酶活性高，價格低廉，可生產性強，能夠滿足工業化、大規模應用的需求，具有較好的應用前景；

(4)本實用新型的干燥方式新穎，外界干擾較小，能夠有效保證測定結果的準確性，具有較高的測定精度；

(5)本實用新型測定裝置的體積小、重量輕、存儲方便，便于攜帶。

附圖說明

圖1是本實用新型中測定裝置在玻璃板上的結構示意圖。

圖2為實施例1制備裝置的盛放容器工作的原理示意圖。

圖中標記：1為玻璃纖維素膜，2為麥麩酯酶酶液，3為盛放容器，4為固定化麥麩酯酶的膜片，5為玻璃板。

具體實施方式

下面結合附圖，對本實用新型作詳細的說明。

為了使本實用新型的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本實用新型進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本實用新型，并不用于限定本實用新型。

實施例1

如圖所示，本實用新型中用于麥麩酯酶測定裝置的制備裝置，包括盛放容器、固定化載體膜、干燥設備。本實施例中，盛放容器采用燒杯；固定化載體膜采用玻璃纖維素膜。作為優選，干燥設備包括玻璃板、超凈工作臺，吸附麥麩酯酶酶液的固定化載體膜經水洗去表面殘渣后能置于玻璃板上，超凈工作臺的排風扇能對玻璃板上的固定化載體膜進行排風干燥。

采用前述制備裝置固定化麥麩酯酶的過程如下。

(1)制備固定化載體膜

將玻璃纖維素膜裁剪為1cm×1cm規格大小，用超純水洗去表面殘渣，室溫晾干備用。

(2)制備麥麩酯酶粗酶液

稱取5g粉碎后的麥麩，加入25mL pH6.5的磷酸氫鈉緩沖液配制的0.15mol/L NaNO₃提取液，攪拌均勻后置于35℃的水浴鍋內水浴靜置提取60min，紗布粗過濾后8000r/min冷凍離心5min，取上清液過濾，即得麥麩酯酶粗酶液。

(3)制備固定化麥麩酯酶液

取1mL麥麩酯酶粗酶液于燒杯中，加入3mL0.2mol/L pH7.0磷酸氫鈉鹽緩沖液，搖勻備用，得到固定化麥麩酯酶液。

(4)麥麩酯酶的固定化

向步驟(3)的燒杯中加入玻璃纖維素膜，然后將燒杯置于水浴鍋中，在29℃水浴靜置4h，完成麥麩酯酶的固定化。

(5)干燥

待固定化結束后，取出含有麥麩酯酶的玻璃纖維素膜，并置于玻璃板上。然后，將該玻璃板放入超凈工作臺，打開排風扇，將酶片風干，以此干燥固定化麥麩酯酶膜片，得到固定化麥麩酯酶的膜片，即麥麩酯酶測定裝置。該固定化麥麩酯酶的膜片包括固定化載體膜、設置在固定化載體膜上的麥麩酯酶層。本實施例制備的固定化麥麩酯酶的膜片如圖2所示。

(6)保存

將制備的固定化麥麩酯酶的膜片保存在干燥、避光、低溫(2～8℃)環境中。

(7)固定化酶活回收率測定

取0.25mL稀釋后的植物酯酶液，加入到4.25mLpH7.2的磷酸氫鈉緩沖液中，加入0.25mLα-乙酸萘酯(濃度為8×10^-4mol/L)溶液，放入40℃恒溫水浴5min，然后加入0.25mL4.25％SDS搖勻，之后加入0.25mL0.03％固蘭B鹽溶液搖勻顯色，加入0.25mL1:1鹽酸溶液搖勻有于535nm處讀取吸光度值。以未加麥麩酯酶酶液的反應液作試劑空白，以吸光度值計算酶活大小。按照酶活習慣計算方法，將每分鐘催化分解1μmo1α-乙酸萘酯所需的酶量定義為1U。計算公式如下：

$E=\frac{(b+k\×{\mathrm{OD}}_{535nm})\×V}{5\×V_0}\×N$

式中E——每毫升粗酶液酯酶活力，U/mL

N——酶液的稀釋倍數

k——某一pH下α-萘酚的標準曲線的斜率

b——標準曲線截距

OD_535nm——反應后在波長535nm處測得的吸光度

V——反應體系總體積

V₀——測定酶活所用酶液體積

按照如上中酶活測定的方法，將游離態酶換為固定化酶膜片測定固定化酶活，將每分鐘催化分解1μmo1α-乙酸萘酯所需的固定化酶量定義為1U。計算公式如下：

$E_0=\frac{(b+k\×{\mathrm{OD}}_{535nm})\×V}{5\×S}$

式中E₀——每平方厘米固定化膜片酯酶活力，U/cm²

k——某一pH下α-萘酚的標準曲線的斜率

b——標準曲線截距

OD_535nm——反應后在波長535nm處測得的吸光度

V——反應體系總體積

S——酶膜片面積，cm²

按以下公式計算酶活回收率：

當采用玻璃纖維素膜規格大小為1cm×1cm，酶液用0.2mol/L pH7.0磷酸氫鈉鹽緩沖液稀釋4倍，固定化時間4h，固定化溫度29℃，在此條件下測定的酶活回收率為27.51％。

(8)固定化酶檢測農藥殘留

取固定化酶膜片(即步驟6制備的固定化麥麩酯酶的膜片)，加入到4.25mL不同濃度農藥(0.2mol/LpH7.2磷酸緩沖液稀釋)中，放置35℃水浴鍋中恒溫15min后，加入0.25mLα-乙酸萘酯溶液，40℃恒溫水浴5min，然后加入0.25mL4.25％SDS搖勻，再加入0.25mL0.03％固蘭B鹽溶液搖勻，加入0.25mL1:20鹽酸溶液搖勻后在535nm處讀取OD值?？瞻捉M將4.25mL農藥替換成4.25mL磷酸鹽緩沖液(pH值為7.2)，用未加α-乙酸萘酯的反應液作空白對照，每組實驗設置3次平行。

酶活抑制率計算公式：

式中：

A_未抑制：沒有農藥抑制時的吸光度值

A_抑制：某濃度農藥抑制時的吸光度值

將每種農藥均用甲醇配制成濃度為10mg/L的標準儲備液，然后用pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液稀釋成2.00mg/L、1.00mg/L、0.50mg/L、0.25mg/L、0.10mg/L、0.005mg/L、的標準工作液。

在此條件下檢測農藥對固定化酶活的抑制率，1.00mg/L的敵敵畏和丁硫克百威對固定化酶的酶活抑制率分別為65.99％和64.06％。

以上所述僅為本實用新型的較佳實施例而已，并不用以限制本實用新型，凡在本實用新型的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本實用新型的保護范圍之內。