本發明涉及藥物領域，特別是涉及一種石金錢龜多肽混合物在制備抗腫瘤藥物領域的應用以及包括該石金錢龜多肽混合物的抗腫瘤藥物。

背景技術：

癌癥仍在嚴重危害著人類生命和健康，全球癌癥病例仍在持續增加，很大程度上是由人口老齡化、世界人口增長和致癌行為習慣增加等所致，特別是發展中國家的吸煙行為。報道提到，中國2015年新增430萬癌癥病例，癌癥的死亡病例超過280萬，有專家預計，中國每年的癌癥新發病例總數到2020年將達到400萬左右，每年病例總數將達到600萬。肺癌仍然是男性最常見癌癥，占癌癥總發病率的17％和死亡率的14％。乳腺癌是女性中最常被診斷出的腫瘤，是女性癌癥的首要死因，占癌癥總病例的23％和死亡病例的14％。發展中國家的癌癥存活期相對較短，主要原因是癌癥診出時間偏晚和治療手段有限。

癌癥主要的治療手段包括手術治療、化療及放療。化學藥物治療是腫瘤治療的主要手段之一，傳統化療的療效與病人對藥物的敏感程度、耐受程度和藥物毒性反應等相關，多數化療藥物屬于細胞毒類抗腫瘤藥，具有擇性差、毒性大和易產生腫瘤多藥耐藥等缺陷，傳統化療用藥已經難以滿足臨床的需要。

由于腫瘤細胞有其特殊的生長模式，如無限增殖、生長信號可進行自我調節，對外界生長抑制信號敏感性較差，以及具有極強的抗細胞凋亡能力，可以自主調控供給營養血管的生成和免疫逃逸等特性，使一般的抗腫瘤藥物很難達到較好的殺死腫瘤細胞的功效。而肽類對腫瘤具有較好的親和力和較強的特異性以及以肽為基礎的治療，與其它小分子化學藥物及抗體相比，由于他們體積微小，因此更容易滲透到組織中，再者就是多肽類具有低毒性等優點，還可以增加對腫瘤治療的敏感度，因此成為近年來抗腫瘤治療新型抗癌方法研究的熱點之一。雖然多肽類化合物具有一定的活性，尤其是在抗腫瘤方面，但2015版藥典收錄的多肽藥物僅有20多種，且皆是國外的已過專利保護期或未在我國申請專利的藥物，而抗腫瘤肽僅有一種(醋酸奧曲肽)，因此開發出具有自主知識產權的抗腫瘤多肽藥物也成為多肽研發的一個熱點。

技術實現要素：

基于此，有必要提供一種石金錢龜多肽混合物在制備抗腫瘤藥物領域的應用以及包括該石金錢龜多肽混合物的抗腫瘤藥物。

一種石金錢龜多肽混合物在制備抗腫瘤藥物領域的應用。

在一個實施例中，所述石金錢龜多肽混合物的平均分子質量為2000～3000。

在一個實施例中，所述石金錢龜多肽混合物包括1470條肽段和313個蛋白質。

在一個實施例中，所述石金錢龜多肽混合物包括具有抗腫瘤活性的7個功能性蛋白：Ras-相關蛋白、T復合蛋白-1亞基δ、GTP結合蛋白、熱休克蛋白90、Ctr轉運蛋白、熱休克同源蛋白71和肌動蛋白4。

在一個實施例中，所述石金錢龜多肽混合物通過如下方法制得：

按照質量比為1：5～10將石金錢龜肉糜與超純水混合，在溫度為40℃～50℃的范圍內，調節pH為7～8，加入中性蛋白酶并充分反應，得到反應液；

對所述反應液進行滅酶處理后，離心除去沉淀并保留上清液，對所述上清液進行冷凍干燥，得到所述石金錢龜多肽混合物。

在一個實施例中，所述調節pH為7～8的操作為：采用NaOH調節pH為7～8。

在一個實施例中，所述滅酶處理為：80℃～90℃熱處理5min～10min。

在一個實施例中，所述離心為：6000r/min～10000r/min離心10min～20min。

在一個實施例中，所述抗腫瘤藥物為抗乳腺癌藥物。

一種抗腫瘤藥物，包括石金錢龜多肽混合物。

石金錢龜多肽混合物具有良好的抗腫瘤的作用，經過試驗驗證，石金錢龜多肽混合物可明顯抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7的增殖，可阻滯MDA-MB-231的G2-M期、可阻滯MCF-7的S期，并可明顯抑制乳腺癌細胞MCF-7在BALB/c-Nude裸鼠體內的增殖。因此，石金錢龜多肽混合物在制備抗腫瘤藥物領域具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1a～圖1j為石金錢龜多肽混合物抑制腫瘤細胞MDA-MB-231、HeLa、SGC-7901、COLO-320、MCF-7、Hep-G2、PC-3、K562、A-375和A-549的增殖的測定圖；

圖2a為石金錢龜多肽混合物對乳腺癌細胞MDA-MB-231的細胞周期影響測定對比圖；

圖2b為石金錢龜多肽混合物對乳腺癌細胞MDA-MB-231的細胞周期影響測定柱狀圖；

圖3a為石金錢龜多肽混合物對乳腺癌細胞MCF-7的細胞周期影響測定對比圖；

圖3b為石金錢龜多肽混合物對乳腺癌細胞MCF-7的細胞周期影響測定柱狀圖；

圖4a為石金錢龜多肽混合物對MCF-7細胞瘤在裸鼠體內生長狀況影響的測定對比圖；

圖4b為石金錢龜多肽混合物對MCF-7細胞瘤在裸鼠體內生長狀況影響的體積測定對比圖；

圖4c為石金錢龜多肽混合物對MCF-7細胞瘤在裸鼠體內生長狀況影響的瘤重測定對比圖。

具體實施方式

為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合具體實施例對本發明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于充分理解本發明。但是本發明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似改進，因此本發明不受下面公開的具體實施的限制。

本發明公開了一種石金錢龜多肽混合物在制備抗腫瘤藥物領域的應用。

優選的，石金錢龜多肽混合物的平均分子質量為2000～3000。

優選的，石金錢龜多肽混合物包括1470條肽段和313個蛋白質。

優選的，石金錢龜多肽混合物包括Ras-相關蛋白(Rab)、T復合蛋白-1亞基δ(TCP-1)、GTP結合蛋白(SAR1b)、熱休克蛋白90(HSP90a)、Ctr轉運蛋白(ATOX1)、熱休克同源蛋白71(71KDa)和肌動蛋白4。

Ras-相關蛋白(Rab)、T復合蛋白-1亞基δ(TCP-1)、GTP結合蛋白(SAR1b)、熱休克蛋白90(HSP90a)、Ctr轉運蛋白(ATOX1)、熱休克同源蛋白71(71KDa)和肌動蛋白4均具有抗腫瘤活性。

Ras-相關蛋白(Rab)的序列如SEQ ID No.1所示，T復合蛋白-1亞基δ(TCP-1)的序列如SEQ ID No.2所示，GTP結合蛋白(SAR1b)的序列如SEQ ID No.3所示，熱休克蛋白90(HSP90a)的序列如SEQ ID No.4所示，Ctr轉運蛋白(ATOX1)的序列如SEQ ID No.5所示，熱休克同源蛋白71(71KDa)的序列如SEQ ID No.6所示，肌動蛋白4的序列如SEQ ID No.7所示。

具體的，石金錢龜多肽混合物通過如下方法制得：

按照質量比為1：5～10將石金錢龜肉糜與超純水混合，在溫度為40℃～50℃的范圍內，調節pH為7～8，加入中性蛋白酶并充分反應(中性蛋白酶的加入量為37313.43U/g，反應時間優選為10h)，得到反應液；

對反應液進行滅酶處理后，離心除去沉淀并保留上清液，對上清液進行冷凍干燥，得到石金錢龜多肽混合物。

制得的石金錢龜多肽混合物經過檢測，包括Ras-相關蛋白(Rab)、T復合蛋白-1亞基δ(TCP-1)、GTP結合蛋白(SAR1b)、熱休克蛋白90(HSP90a)、Ctr轉運蛋白(ATOX1)、熱休克同源蛋白71(71KDa)和肌動蛋白4。

超純水是指將水中的導電介質幾乎全部去除，又將水中不離解的膠體物質、氣體和有機物均去除至很低程度的水。一般來說，超純水為電阻率大于18MΩ×cm的水。

優選的，調節pH為7～8的操作為：采用NaOH調節pH為7～8。

優選的，滅酶處理為：80℃～90℃熱處理5min～10min。

更優選的，滅酶處理為：85℃熱處理10min。

優選的，離心為：6000r/min～10000r/min離心10min～20min。

更優選的，離心為：8000r/min離心30min。

優選的，抗腫瘤藥物為抗乳腺癌藥物。

本發明還公開了一種抗腫瘤藥物，包括上述石金錢龜多肽混合物。

石金錢龜多肽混合物具有良好的抗腫瘤的作用，經過試驗驗證，石金錢龜多肽混合物可明顯抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7的增殖，可阻滯MDA-MB-231的G2-M期、可阻滯MCF-7的S期，并可明顯抑制乳腺癌細胞MCF-7在BALB/c-Nude裸鼠體內的增殖。因此，石金錢龜多肽混合物在制備抗腫瘤藥物領域具有良好的應用前景。

以下為具體實施例。

具體實施例中采用藥物和儀器均為本領域常規選擇。

實施例1、石金錢龜多肽混合物的制備

將10g石金錢龜肉糜與80g超純水混合，在溫度為45℃、pH為7.5的條件下，加入中性蛋白酶(25000U，37313.43U/g)并充分反應10h，得到反應液。

對反應液在85℃滅酶處理10min，8000r/min離心30min，除去沉淀并保留上清液，對上清液進行冷凍干燥，得到粗產物，即石金錢龜多肽混合物

將得到的石金錢龜多肽(GDP)混合物稀釋成原始濃度1g/mL，4℃保存備用。

實施例2、石金錢龜多肽混合物的抗腫瘤性能測定

1、石金錢龜多肽抑制腫瘤細胞增殖的測定

取對數生長期的腫瘤細胞株制成一定濃度的細胞懸液，接種至96孔板，每孔接種5000個細胞(100μL)，置于5％CO₂，37℃培養箱中，培養24h后棄掉原培養基，并用PBS洗一遍，然后分別加入不同濃度的石金錢龜多肽混合物溶液，每個濃度設3個平行孔，同時設加PBS的對照組，置5％CO₂，37℃培養箱，孵育24h后，倒掉原培養基，加PBS洗2遍，然后每孔加10μL MTT溶液，放培養箱孵育4h后，吸去MTT溶液，然后每孔加100μL DMSO溶液，避光充分震蕩后置酶聯免疫檢測儀在570nm波長下測吸光度，計算細胞存活率。

實驗過程中用到的腫瘤細胞株包括：MDA-MB-231、HeLa、SGC-7901、COLO-320、MCF-7、Hep-G2、PC-3、K562、A-375和A-549(均購買于ATCC細胞庫)，實驗結果如圖1a～圖1j所示。

由圖1a～圖1j可以看出，石金錢龜多肽混合物對MCF-7和MDA-MB-231的增殖具有明顯抑制作用。

2、石金錢龜多肽對腫瘤細胞細胞周期的影響

取對數生長期的乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231制成一定濃度的細胞懸液(1×10⁶個/mL)，加入24孔(0.2mL/孔)培養板置于5％CO₂，37℃培養箱中，24h后加入不同稀釋度的石金錢龜多肽，每個濃度設3個復孔，繼續培養24h。用PBS液洗2次，用預冷的75％乙醇固定過夜，加入碘化丙啶染料，4℃避光染色50min，400目尼龍網過濾，用流式細胞儀檢測乳腺癌細胞的細胞周期分布情況。試驗結果如圖2a、圖2b、圖3a和圖3b所示。

由圖2a、圖2b、圖3a和圖3b可以看出，石金錢龜多肽混合物對MCF-7和MDA-MB-231的細胞周期具有抑制作用，石金錢龜多肽混合物可阻滯MDA-MB-231細胞的G2-M期、可阻滯MCF-7細胞的S期。

3、石金錢龜多肽動物實驗測定

實驗條件(實驗動物和飼養環境)：40只雄性BALB/c-Nude裸鼠購買于中山大學實驗動物中心，鼠齡4～5周，體重16～18g。接種腫瘤前先飼養觀察一周左右。將裸鼠飼養在暨南大學實驗動物中心，SPF級別，飼養條件受到嚴格控制，恒溫、恒溫，并且環境中無任何病原體。裸鼠飼料及飲水都經過高溫滅菌。

分組：將40只裸鼠分為5組，接種MCF-7細胞。

準備細胞：觀察裸鼠的一周時間里，取對數生長期的MCF-7細胞，傳代于100mm的培養皿中，置于5％CO₂，37℃培養箱中培養，收集足夠多的乳腺癌細胞。

裸鼠異體移植瘤模型的建立：取對數生長期的MCF-7細胞，消化(1000rpm×5min)，PBS洗兩遍，吸盡PBS，轉移至15mL離心管中，收集MCF-7細胞，用稀釋好的高濃度基質膠混勻細胞(PBS：基質膠＝2:1)。調整細胞的密度，使得裸鼠接種MCF-7細胞的密度為5×10⁶個/只，MCF-7細胞的密度為6×10⁶個/只，每只裸鼠接種0.2mL混有細胞的基質膠。

給藥：接種完細胞約一周，待腫瘤長至100mm³左右，將裸鼠隨機分為5組，陰性對照組，Control組，高劑量組，中劑量組和低劑量組，隔天給藥一次。每次給藥前先稱量裸鼠的體重并用游標卡尺記錄裸鼠腫瘤的長徑和短徑，共給藥15天。

處死：最后一次給藥結束24h內，斷頸法處死裸鼠，剝離其腫瘤進行稱重，計算各組體內腫瘤的抑制率。

結果處理：腫瘤體積(mm³)＝1/2×(L×W2)，L為腫瘤的長徑，W為腫瘤的短徑。腫瘤抑制率(％)＝(1-給藥組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)×100％。實驗結果如圖4a、圖4b和圖4c所示。

由圖4a、圖4b和圖4c可以看出，石金錢龜多肽混合物可明顯抑制乳腺癌細胞MCF-7在BALB/c-Nude裸鼠體內的增殖。

以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳凱聯龜業有限公司

<120> 石金錢龜多肽混合物的應用以及抗腫瘤藥物

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 225

<212> PRT

<213> Ras-相關蛋白

<400> 1

Gly His Arg Gln Ser Trp Gly Gly Gln Gly Trp Ala Gly Arg Gly Cys

1 5 10 15

Arg Ser Arg Val Arg Gly Thr Asp Arg Ala Val Tyr Cys Thr Gly Pro

20 25 30

Ala Pro Leu Gly Pro Pro Phe Asp Gly Phe Cys Cys Cys Val Phe Leu

35 40 45

Pro Gly Val Glu Phe Gly Ala Arg Met Ile Asn Ile Asp Ser Lys Gln

50 55 60

Ile Lys Leu Gln Ile Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Ser Phe Arg Ser

65 70 75 80

Ile Thr Arg Ser Tyr Tyr Arg Gly Ala Ala Gly Ala Leu Leu Val Tyr

85 90 95

Asp Ile Thr Arg Arg Glu Thr Phe Asn His Leu Thr Ser Trp Leu Glu

100 105 110

Asp Ala Arg Gln His Ser Ser Ser Asn Met Val Ile Met Leu Ile Gly

115 120 125

Asn Lys Ser Asp Leu Glu Ser Arg Arg Asp Val Gln Lys Ala Glu Gly

130 135 140

Glu Ala Phe Ala Arg Glu His Gly Leu Val Phe Met Glu Thr Ser Ala

145 150 155 160

Lys Thr Ser Thr Asn Val Glu Glu Ala Phe Ile Asp Thr Ala Lys Glu

165 170 175

Ile Tyr Arg Lys Ile Gln Gln Gly Leu Phe Asp Val Asn Asn Glu Ala

180 185 190

Asn Gly Ile Lys Ile Gly Pro Gln Gln Pro Ser Gly Ala Ala Pro Gly

195 200 205

Ala Gly Ser Arg His Ser Pro Gln Gly Ser Gly Asp Ser Ser Gly Cys

210 215 220

Cys

225

<210> 2

<211> 586

<212> PRT

<213> T復合蛋白-1 亞基δ

<400> 2

Pro Leu Ser Pro Val Gly Pro Glu Val Gln Arg Leu Arg Arg Arg Val

1 5 10 15

Leu Glu Ala Ser Arg Arg Gly Ser Leu Val Arg Ala Gly Gly Pro Gly

20 25 30

Arg Ser Val Ser Ile Gln Ser Leu Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gly Val

35 40 45

Ala Met Pro Glu Asn Ala Gly Ser Arg Ala Phe Thr Gly Gly Asn Gly

50 55 60

Gly Arg Lys Arg Ser Ala Tyr Gln Asp Arg Asp Lys Pro Ala Gln Ile

65 70 75 80

Arg Phe Ser Asn Ile Ser Ala Gly Lys Ala Val Ala Asp Ala Ile Arg

85 90 95

Thr Ser Leu Gly Pro Lys Gly Met Asp Lys Met Ile Gln Asp Gly Lys

100 105 110

Gly Asp Val Thr Ile Thr Asn Asp Gly Ala Thr Ile Leu Lys Gln Met

115 120 125

Gln Val Leu His Pro Ala Ala Lys Met Leu Val Glu Leu Ser Lys Ala

130 135 140

Gln Asp Ile Glu Ala Gly Asp Gly Thr Thr Ser Val Val Val Ile Ala

145 150 155 160

Gly Ala Leu Leu Asp Ala Cys Ser Arg Leu Leu Gln Lys Gly Ile His

165 170 175

Pro Thr Ile Ile Ser Glu Ser Phe Gln Lys Ala Leu Asp Lys Ser Thr

180 185 190

Glu Val Leu Thr Asp Met Gly Gln Pro Val Glu Leu Ser Asp Arg Glu

195 200 205

Thr Leu Leu Asn Ser Ala Thr Thr Ser Leu Asn Ser Lys Val Val Ser

210 215 220

Gln Tyr Ser Ser Leu Leu Ser Pro Met Ser Val Asp Ala Val Met Lys

225 230 235 240

Val Ile Asp Pro Thr Thr Ala Ser Ser Val Asp Leu Arg Asp Ile Lys

245 250 255

Ile Val Lys Lys Leu Gly Gly Thr Ile Asp Asp Cys Glu Leu Val Glu

260 265 270

Gly Leu Val Leu Thr Gln Lys Leu Ala Asn Thr Gly Val Thr Arg Val

275 280 285

Glu Lys Ala Lys Ile Gly Leu Ile Gln Phe Cys Leu Ser Ala Pro Lys

290 295 300

Thr Asp Met Asp Asn Gln Ile Val Val Ser Asp Tyr Ala Gln Met Asp

305 310 315 320

Arg Val Leu Arg Glu Glu Arg Ala Tyr Ile Leu Asn Leu Val Lys Gln

325 330 335

Ile Lys Lys Ala Gly Cys Asn Val Leu Leu Ile Gln Lys Ser Ile Leu

340 345 350

Arg Asp Ala Leu Ser Asp Leu Ala Leu His Phe Leu Asn Lys Met Lys

355 360 365

Ile Met Val Ile Lys Asp Ile Glu Arg Glu Asp Ile Glu Phe Ile Cys

370 375 380

Lys Thr Ile Gly Thr Lys Pro Val Ala His Ile Asp Gln Phe Ile Ala

385 390 395 400

Asp Thr Leu Gly Ser Ala Glu Leu Ala Glu Glu Val Asn Leu Asn Gly

405 410 415

Ser Gly Lys Leu Ile Lys Ile Thr Gly Cys Ala Ser Pro Gly Lys Thr

420 425 430

Val Thr Ile Val Val Arg Gly Ser Asn Lys Leu Val Met Glu Glu Ala

435 440 445

Glu Arg Ser Ile His Asp Ala Leu Cys Val Ile Arg Cys Leu Val Lys

450 455 460

Lys Arg Ala Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ala Pro Glu Ile Glu Leu Ala

465 470 475 480

Leu Arg Leu Asn Glu Tyr Ala Arg Thr Leu Ser Gly Met Asp Ser Tyr

485 490 495

Cys Val Arg Ala Tyr Gly Asp Ala Met Glu Val Ile Pro Ser Thr Leu

500 505 510

Ala Glu Asn Ala Gly Leu Asn Pro Ile Ser Thr Val Thr Glu Leu Arg

515 520 525

Asn Arg His Ala Gln Gly Glu Lys Thr Ala Gly Ile Asn Ile Arg Lys

530 535 540

Gly Gly Ile Ser Asn Ile Leu Glu Glu Leu Val Val Gln Pro Leu Leu

545 550 555 560

Val Ser Leu Ser Ala Val Thr Leu Ala Thr Glu Thr Val Arg Ser Ile

565 570 575

Leu Lys Ile Asp Asp Val Val Asn Thr Arg

580 585

<210> 3

<211> 201

<212> PRT

<213> GTP結合蛋白

<400> 3

Asp Ser Asp Met Ser Phe Ile Phe Asp Trp Ile Tyr Ser Gly Phe Ser

1 5 10 15

Ser Val Leu Gln Phe Leu Gly Leu Tyr Lys Lys Ser Gly Lys Leu Val

20 25 30

Phe Leu Gly Leu Asp Asn Ala Gly Lys Thr Thr Leu Leu His Met Leu

35 40 45

Lys Asp Asp Arg Leu Gly Gln His Val Pro Thr Leu His Pro Thr Ser

50 55 60

Glu Glu Leu Thr Ile Ala Gly Met Thr Phe Thr Thr Phe Asp Leu Gly

65 70 75 80

Gly His Thr Gln Ala Arg Arg Val Trp Lys Asn Tyr Leu Pro Ala Ile

85 90 95

Asn Gly Ile Val Phe Leu Val Asp Cys Ala Asp His Glu Arg Leu Thr

100 105 110

Glu Ser Lys Glu Glu Leu Asp Leu Leu Met Thr Asp Glu Thr Val Ala

115 120 125

Asn Val Pro Ile Leu Ile Leu Gly Asn Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala

130 135 140

Ile Ser Glu Glu Arg Leu Arg Asp Met Phe Gly Leu Tyr Gly Gln Thr

145 150 155 160

Thr Gly Lys Gly Asn Val Ser Leu Lys Glu Leu Asn Ala Arg Pro Leu

165 170 175

Glu Val Phe Met Cys Ser Val Leu Lys Arg Gln Gly Tyr Gly Glu Gly

180 185 190

Phe Arg Trp Met Ala Gln Tyr Ile Asp

195 200

<210> 4

<211> 737

<212> PRT

<213> 熱休克蛋白90

<400> 4

Gly Ala Val Ala Ala Ile Ala Ala Lys Met Pro Glu Ala Val Gln Thr

1 5 10 15

Gln Asp Gln Pro Met Glu Glu Glu Val Glu Thr Phe Ala Phe Gln Ala

20 25 30

Glu Ile Ala Gln Leu Met Ser Leu Ile Ile Asn Thr Phe Tyr Ser Asn

35 40 45

Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ser Ser Asp Ala Leu

50 55 60

Asp Lys Ile Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Asp Pro Ser Lys Leu Asp Ser

65 70 75 80

Gly Lys Asp Leu Lys Ile Asn Ile Leu Pro Asn Lys His Asp Arg Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Val Asp Thr Gly Ile Gly Met Thr Lys Ala Asp Leu Val

100 105 110

Asn Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Lys Ala Phe Met Glu

115 120 125

Ala Leu Gln Ala Gly Ala Asp Ile Ser Met Ile Gly Gln Phe Gly Val

130 135 140

Gly Phe Tyr Ser Ala Tyr Leu Val Ala Glu Lys Val Thr Val Ile Thr

145 150 155 160

Lys His Asn Asp Asp Glu Gln Tyr Ala Trp Glu Ser Ser Ala Gly Gly

165 170 175

Ser Phe Thr Val Arg Leu Asp Asn Gly Glu Pro Leu Gly Arg Gly Thr

180 185 190

Lys Val Ile Leu His Leu Lys Glu Asp Gln Thr Glu Tyr Leu Glu Glu

195 200 205

Arg Arg Ile Lys Glu Ile Val Lys Lys His Ser Gln Phe Ile Gly Tyr

210 215 220

Pro Ile Thr Leu Phe Val Glu Lys Glu Arg Asp Lys Glu Val Ser Asp

225 230 235 240

Asp Glu Ala Glu Glu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Glu Lys Glu Glu Lys

245 250 255

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260 265 270

Glu Lys Lys Asp Gly Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Glu Lys

275 280 285

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Leu Asn Ile Ser Arg Glu Met Leu Gln Gln Ser Lys Ile Leu Lys Val

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