本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗腫瘤功能的多肽。

背景技術(shù)：

黑色素瘤是一種惡性程度比較高的腫瘤，主要由皮膚和其他器官的黑素細(xì)胞產(chǎn)生的。原發(fā)性黑素瘤均由表皮內(nèi)的黑素細(xì)胞增生所致，其表現(xiàn)為色素濃重的逐漸增大，周圍可繞以紅暈。其發(fā)病率相對(duì)低，但惡性度大，死亡率高，尤其是轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤。

在醫(yī)學(xué)上，對(duì)于惡性黑色素瘤的治療，目前除了手術(shù)切除的方法之外，像化療、放療等手段對(duì)黑色素瘤的治療效果都是不盡人意的。雖說(shuō)手術(shù)治療對(duì)早期的實(shí)體瘤治療效果較好，但是，現(xiàn)在很多腫瘤在發(fā)現(xiàn)的時(shí)候已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移、病變，手術(shù)治療難以解決根本問(wèn)題，并且手術(shù)切除具有很高的風(fēng)險(xiǎn)，會(huì)帶來(lái)比較大的副作用。因此，尋求一種有效治療惡性黑色素瘤的方法仍然是醫(yī)學(xué)界的一大難題。

近年中，多數(shù)人把目光投向藥物治療，藥物治療不僅可以作為一種治療黑色素瘤的有效手段，并且可以作為手術(shù)治療后的一種輔助療法，同時(shí)起到預(yù)防、治療與防止復(fù)發(fā)的效果。因此，研發(fā)一種高效低毒的抗黑色素瘤藥物迫在眉睫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤功能的多肽，能特定性的殺死黑色素瘤細(xì)胞。

本發(fā)明提供的多肽，其結(jié)構(gòu)式如下：

再一個(gè)方面，本發(fā)明所提供的多肽用于制備用于治療黑色素瘤的制品；

本發(fā)明再一個(gè)方面提供一種用于治療黑色素瘤的溶液，其中包含有藥理有效濃度的上述多肽；

所述的溶液，為hepes緩沖溶液，ph值為7.4；

所述的藥理有效濃度，其濃度為2-10mm；

所述的藥理有效濃度，優(yōu)選為8mm。

本發(fā)明的多肽的氨基酸殘基良好的生物相容性決定了多肽分子綠色環(huán)保的特點(diǎn)，因此相對(duì)于其他的藥物來(lái)說(shuō)毒性更小。在藥效方面，本發(fā)明的多肽在殺死黑色素瘤細(xì)胞的同時(shí)不影響正常細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有很強(qiáng)的選擇性，對(duì)人體健康影響較小。本發(fā)明的多肽分子具有高效殺死黑色素瘤細(xì)胞的能力，殺傷率可以達(dá)到98％以上，具有很好的藥物開(kāi)發(fā)前景。

附圖說(shuō)明

圖1：結(jié)構(gòu)式圖，其中a)為多肽的分子式，b)和c)為多肽在酪氨酸酶催化下可能的反應(yīng)式；

圖2：其中a、b分別為加酶前后的透射電子顯微鏡圖和溶液狀態(tài)圖；

圖3：.a、b、c、d分別為多肽溶液加入完全培養(yǎng)基、含b16細(xì)胞的培養(yǎng)基、含hela細(xì)胞的培養(yǎng)基和含nih3t3細(xì)胞的培養(yǎng)基一天之后的溶液狀態(tài)；

圖4：b16細(xì)胞在8mm多肽溶液中培養(yǎng)兩天后，在倒置熒光顯微鏡下的觀察圖；

圖5：不同濃度的多肽與b16細(xì)胞作用不同時(shí)間后的ldh釋放實(shí)驗(yàn)圖；

圖6：.nih3t3細(xì)胞和hela細(xì)胞在8mm多肽溶液中培養(yǎng)兩天后，在倒置熒光顯微鏡下的觀察圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的多肽是借助微波多肽合成儀，利用固相合成方法合成的，相應(yīng)氨基酸原料均購(gòu)買于吉爾生化有限公司。酪氨酸酶購(gòu)買于sigma公司，小鼠黑色素瘤細(xì)胞(b16)購(gòu)買于上海細(xì)胞庫(kù)。

實(shí)施例1多肽的設(shè)計(jì)及效果檢測(cè)

申請(qǐng)人設(shè)計(jì)并合成一種含有dopa殘基的多肽分子，利用dopa殘基對(duì)酪氨酸酶的響應(yīng)性，同時(shí)結(jié)合黑色素瘤細(xì)胞過(guò)量表達(dá)酪氨酸酶、能夠促進(jìn)含dopa多肽分子在黑色素瘤細(xì)胞中的組裝的特點(diǎn)，達(dá)到利用含dopa多肽分子殺死黑色素瘤細(xì)胞的效果。

本發(fā)明的多肽的結(jié)構(gòu)式如下：

該多肽分子在水溶液中，濃度在2-8mm時(shí)能夠自組裝形成細(xì)的納米纖維，當(dāng)加入≥10u酪氨酸酶之后，在酪氨酸酶的催化下，多肽分子側(cè)鏈上的二酚羥基氧化轉(zhuǎn)變?yōu)楸锦S后，苯醌與多肽側(cè)鏈上的氨基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，如圖1.b)、c)所示，促使纖維之間交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)狀凝膠。將一定量的多肽溶液與一定數(shù)量的b16細(xì)胞混合，最終多肽濃度在2-8mm之間，細(xì)胞的濃度大約10⁴-10⁶個(gè)/ml時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在b16細(xì)胞釋放大量酪氨酸酶的催化下，多肽溶液轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，同時(shí)b16細(xì)胞被大量殺死。

將多肽溶解在400ul濃度為25mmhepes緩沖溶液中，分別添加0u和10u酪氨酸酶，確保多肽最終濃度為8mm,靜置一周后均自組裝形成納米纖維，并且不加酶的呈流動(dòng)狀態(tài)，加酶的形成可以倒立成固狀水凝膠，如圖2所示。

實(shí)施例2：b16細(xì)胞誘導(dǎo)下多肽成膠

將多肽溶解在400ul濃度為25mmhepes緩沖溶液中，分別加入100ul的完全培養(yǎng)基、含b16細(xì)胞的培養(yǎng)基、含hela細(xì)胞的培養(yǎng)基和含nih3t3細(xì)胞的培養(yǎng)基，確保最終多肽濃度為8mm，加入的細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞的密度大約在10⁶個(gè)/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有加入含b16細(xì)胞的培養(yǎng)基的多肽溶液在一天之后形成可以倒立的水凝膠，其余的均呈可流動(dòng)的液體狀態(tài)，如圖3所示。

實(shí)施例3：多肽水凝膠對(duì)b16細(xì)胞的抗腫瘤性能

上述實(shí)驗(yàn)證明了b16細(xì)胞能促使多肽溶液成膠，為了檢測(cè)b16細(xì)胞在多肽水凝膠中的生長(zhǎng)狀態(tài)，使用熒光染料calceinam與pi進(jìn)行活/死細(xì)胞染色，然后使用倒置熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，多肽水凝膠上方，大量b16細(xì)胞呈碘化丙啶pi染色后的紅色，細(xì)胞形態(tài)為收縮的球狀，幾乎觀測(cè)不到calceinam染色后的綠色細(xì)胞，表示大量b16細(xì)胞已經(jīng)死亡，如圖4所示。

考察了多肽濃度對(duì)b16細(xì)胞的殺傷能力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)當(dāng)b16細(xì)胞在濃度≥2mm/l多肽溶液中培養(yǎng)超過(guò)三天后，多肽對(duì)b16細(xì)胞的殺死率可以達(dá)到99％以上。即使在低濃度的多肽溶液中，殺死率依然可以達(dá)到60％以上，表現(xiàn)出良好的抗黑色素瘤效果。

實(shí)施例4：多肽對(duì)其他細(xì)胞毒性的研究

將nih3t3細(xì)胞和hela細(xì)胞分別與多肽溶液混合培養(yǎng)，兩天后，用熒光染料calceinam與pi進(jìn)行活/死細(xì)胞染色，然后使用倒置熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示nih3t3細(xì)胞和hela細(xì)胞大量呈表示存活的綠色；極少量呈表示細(xì)胞死亡的紅色，如圖6所示。說(shuō)明本發(fā)明的多肽可以高效殺死黑色素瘤細(xì)胞，且對(duì)其他細(xì)胞影響較小，具有很強(qiáng)的專一性。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤功能的多肽，本發(fā)明的多肽能特定性的殺死黑色素瘤細(xì)胞。本發(fā)明的多肽的氨基酸殘基良好的生物相容性決定了多肽分子綠色環(huán)保的特點(diǎn)，因此相對(duì)于其他的藥物來(lái)說(shuō)毒性更小。在藥效方面，本發(fā)明的多肽在殺死黑色素瘤細(xì)胞的同時(shí)不影響正常細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有很強(qiáng)的選擇性，對(duì)人體健康影響較小。本發(fā)明的多肽分子具有高效殺死黑色素瘤細(xì)胞的能力，殺傷率可以達(dá)到98％以上，具有很好的藥物開(kāi)發(fā)前景。

技術(shù)研發(fā)人員：趙玉榮;徐海;陳翠霞;白靖琨;楊威
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)石油大學(xué)（華東）
技術(shù)研發(fā)日：2017.03.29
技術(shù)公布日：2017.07.14