本發明涉及應用生物技術原理人工培育真菌的技術領域，具體涉及蛹蟲草的培育，更具體地涉及一種蛹蟲草液體菌種的培育方法和應用及其使用的培養基。

背景技術：

蛹蟲草（cordycepsmilitaris）隸屬于真菌界（fungi）、子囊菌門（ascomycota）、子囊菌綱（ascomycetes）、糞殼菌亞綱（sordariomycetidae）、肉座菌目（hypocreales）、麥角菌科（clavicipitaceae）、蟲草屬（cordyceps）。蛹蟲草是非常著名的藥食兩用的子囊真菌，也是獲得蟲草素的主要來源，具有很高的開發利用價值。近年來，隨著野生冬蟲夏草資源的日漸枯竭，其價格不斷攀升，從而促使人們尋找野生冬蟲夏草的替代品。由于蛹蟲草具有與冬蟲夏草相近的藥用與食用價值，加之蛹蟲草更加容易馴化，因此受到人們越來越多的關注。

但是，由于傳統工藝中液體配方的營養不全面，導致蛹蟲草發菌慢，菌絲較易老化，長勢弱，菌絲體色澤較暗，子實體產量低。因此，我們對液體菌種的培養液配方、液體菌種的培育方法進行了改良。

技術實現要素：

本發明提供了一種蛹蟲草液體菌種的培育方法，該方法包括：

將蛹蟲草的純菌種接種到液體培養基中，搖床培養得到液體菌種；

所述液體培養基按照重量份數計，包括：馬鈴薯9-10份，鮮蠶蛹9-10份的浸出液，葡萄糖0.8-1份，蛋白胨0.8-1份，酵母浸粉0.8-1份，磷酸二氫鉀0.09-0.1份，硫酸鎂0.04-0.05份，脫脂蠶蛹粉0.09-0.1份，氫氧化鈉0.0005-0.0006份，水45-60份，維生素b10.01-0.02份；

所述水的重量份數包含蠶蛹浸出液中的水。

本發明通過液體菌種的特定配方并結合搖床培養，可良好保持菌種的遺傳特性，減少菌種在菌絲分解斷裂中出現的退化，保持菌種活力和發菌速度，促進后續菌絲體的轉色，增加子實體產量。解決了蛹蟲草菌種退化、發菌弱、后期轉色慢、子實體產量少等問題。

進一步，所述液體培養基按照重量份數計，包括：馬鈴薯9.5份，鮮蠶蛹9.5份的浸出液，葡萄糖0.95份，蛋白胨0.95份，酵母浸粉0.95份，磷酸二氫鉀0.095份，硫酸鎂0.048份，脫脂蠶蛹粉0.095份，氫氧化鈉0.00057份，水47份，維生素b10.014份；所述水的重量份數包含蠶蛹浸出液中的水。

進一步，所述搖床培養的條件為：以200-250r/min搖床培養5-6天，培養溫度為20-22℃。

進一步，所述蠶蛹浸出液為將鮮蠶蛹煮制25-35min后得到的蠶蛹過濾液。

進一步，所述馬鈴薯的蛋白質含量不低于3%，淀粉含量不低于13%，優選13%-15%。

進一步，所述蛋白胨的總氮含量不低于13.5%，氨基酸含量不低于3%。

進一步，所述脫脂蠶蛹粉的蛋白質含量為60%-80%，脂肪含量為5%-8%。

本發明蛹蟲草液體菌種的培育方法可廣泛用于蛹蟲草的培育中，從而提高蛹蟲草子實體的生產效率和產量。

本發明還提供一種培育蛹蟲草的方法，包括：將上述蛹蟲草液體菌種的培育方法制備的液體菌種轉接至子實體培養基，繼續進行培養。

進一步，將蠶蛹浸出液使用過的蠶蛹放入子實體培養基中。

本發明提供一種培育蛹蟲草液體菌種的培養液，按照重量份數計，包括：馬鈴薯9-10份，鮮蠶蛹9-10份的浸出液，葡萄糖0.8-1份，蛋白胨0.8-1份，酵母浸粉0.8-1份，磷酸二氫鉀0.09-0.1份，硫酸鎂0.04-0.05份，脫脂蠶蛹粉0.09-0.1份，氫氧化鈉0.0005-0.0006份，水45-60份，維生素b10.01-0.02份；所述水的重量份數包含蠶蛹浸出液中的水。

本發明上述的培養液可用于蛹蟲草液體菌種的培育，使獲得的菌種不易退化，保持菌種活力和發菌速度，促進后續菌絲體的轉色，增加子實體產量。

具體實施方式

在蛹蟲草的液體菌種培育方法中，按照不同的配方進行培養制作得到的菌種的退化程度和抵抗力不同。其將固體試管種轉接到液體搖床培養液中，通過有一段時間的培養得到搖床液體菌種，再將液體菌種再轉接到子實體培養基中，繼續培養一段時間見光，進行子實體培養即可得到污染率低、高產的蟲草子實體。通過不同的培養液培養的蛹蟲草菌種的生長特性和子實體產量有很大差別，通過本發明培養液配方制作的液體菌種使得菌種菌絲體多，菌種特性穩定，能夠高效的繁殖和生長。

本發明的實施例提供了一種采用特定配方的培養液進行蛹蟲草液體菌種培育的方法，包括配制液體培養基，然后在無菌環境下將固體試管菌種轉接到液體菌種中，再將液體菌種放置搖床上以250r/min搖制5-6天，避光培養溫度為20-22℃，再將搖制好的液體菌種轉接到子實體培養基上。

以下通過實施例對本發明作進一步詳細的說明，但這些內容不應理解為對本發明的限制。其中未具體載明的操作方法依照本領域的常規操作進行，使用的試劑、原料和菌種等均市售獲得。其中培養基的組分如無特別說明，則購自北京奧博星。

實施例

首先配制液體培養基，具體包括：稱取馬鈴薯200g，煮30min后濾掉殘渣，得到馬鈴薯浸出液。將活蠶蛹200g放入鍋中加入1200ml左右水進行煮制，大約30分鐘后過濾得到蠶蛹浸出液。控制馬鈴薯浸出液和蠶蛹浸出液的液體總量為1000ml并混合到一起，然后分別加入葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸20g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、脫脂蠶蛹粉2g、氫氧化鈉0.012g、b10.3g，溶解攪拌均勻分裝在500l三角瓶中，每瓶大約裝取營養液200l，封口時在瓶口位置放一塊2cm*2cm的無菌棉，以便為后期液體菌種增加氧氣。

將裝有液體的三角瓶放置于滅菌鍋中，0.12-0.18mpa下進行蒸汽滅菌，溫度為118-121℃滅菌30分鐘，待壓力降到常壓時打開鍋取出滅菌好的三角瓶營養液，然后取出放涼備用。

將滅菌好的三角瓶放入超凈工作臺中，在紫外線燈下滅菌30-40min，然后在超凈工作臺中將固體試管種轉接到滅好的三角瓶中，再將三角瓶放到滅菌好的暗培室中，在搖床上以250r/min搖制6天，避光培養溫度為21℃，即可得到搖制好的液體菌種。

將液體菌種接到子實體培養基中，進行發菌轉色及子實體培養，40-55天得到子實體。

在本實施例中，液體培養基中添加了蠶蛹粉和蠶蛹浸出液可使菌種的遺傳性得以良好的保持，減少菌種在菌絲分解斷裂中出現的退化，使菌種保持最原始的狀態。蠶蛹浸出液中使用過的蠶蛹可以放入子實體培養基中，再接種液體菌種進行子實體培養，這樣可避免浪費。選擇色澤、品相比較單純的小麥或大米的子實體好，產量也相對高。

各培養基的原料經過嚴格的篩選，如蠶蛹粉、蛋白胨、活體蠶蛹和馬鈴薯都要求質量過關，為正規的生產廠家。其中，馬鈴薯的采購相對要嚴格一些：要求無腐爛、無霉變、無發芽、無損傷、無綠變、完整無損傷的新鮮馬鈴薯，其蛋白質含量為5%，淀粉含量為25%。蠶蛹選取當季活體蠶蛹：新鮮、大小均勻、無傷、無異味，使用前已進行清洗消毒。蛋白胨的總氮含量為18.5%，氨基酸含量為4.5%。脫脂蠶蛹粉的蛋白質含量為75%，脂肪含量為7%。

對比例

按照實施例的步驟培育蛹蟲草，所不同的是采用以下組成的液體培養基：20%馬鈴薯，2%葡萄糖，0.2%蛋白胨，0.09%磷酸二氫鉀，0.04%硫酸鎂，余量為水，其中馬鈴薯的處理與實施例相同。并且，將對比例的菌種搖床培養8天，以使其更充分發菌。

比較實施例與對比例的發菌和采收情況，結果如下：實施例搖床培養6天，對比例搖床培養8天，但實施例的菌球仍明顯比對比例的菌球更濃密、更均勻。比較轉色時間，實施例接種的后期需要4天轉色，而對比例接種的后期需要6天轉色。最后比較采收的產量，實施例的平均產量為300g/盒，對比例的平均產量為270g/盒。

以上所述僅為本發明的優選實施方案，并不用于限制本發明，對于本領域的科技人員，本發明可以有更多的改變和變化，凡在本發明的精神和原則之內所做的任何修改、等同替換、改進均包含在本發明之內。