本發明涉及應用生物技術原理人工培育真菌的技術領域，具體涉及蛹蟲草的培育，更具體地涉及一種蛹蟲草多孢雜交育種的方法及其應用。

背景技術：

蛹蟲草（cordycepsmilitaris）隸屬于真菌界（fungi）、子囊菌門（ascomycota）、子囊菌綱（ascomycetes）、糞殼菌亞綱（sordariomycetidae）、肉座菌目（hypocreales）、麥角菌科（clavicipitaceae）、蟲草屬（cordyceps）。蛹蟲草是非常著名的藥食兩用的子囊真菌，也是獲得蟲草素的主要來源，具有很高的開發利用價值。近年來，隨著野生冬蟲夏草資源的日漸枯竭，其價格不斷攀升，從而促使人們尋找野生冬蟲夏草的替代品。由于蛹蟲草具有與冬蟲夏草相近的藥用與食用價值，加之蛹蟲草更容易馴化，因此受到人們越來越多的關注。

蛹蟲草的生物活性成分主要是蟲草素、蟲草酸和多糖。蟲草素是蛹蟲草的次生代謝產物，為腺苷酸類似物，是從真菌中分離出的第一個核苷酸類抗菌素，具有抑制腫瘤、抗驚厥、抗焦慮等多種藥用價值。

在相關技術中，通常都是以蛹蟲草的菌種開始培養繁殖，進而得到蟲草素、多糖和蟲草酸。常見的蛹蟲草菌種在培養過程中，首先制作固體試管種再將試管種轉接到液體培養液中，震蕩培養一定時間，得到液體母種，得到的液體母種經過擴培后或直接接種到子實體培養基繼續培養。一般而言，蛹蟲草菌種在培養生長過程中會用到固體培養基、液體培養基及子實體培養基；其中固體培養基包括：20%馬鈴薯，5%葡萄糖，3%瓊脂粉；液體培養基包括：20%馬鈴薯，2%葡萄糖，0.2%蛋白胨，0.09%磷酸二氫鉀，0.04%硫酸鎂；子實體固體培養基包括：25%大米或麥子，2.0%蛋白胨，0.07%磷酸二氫鉀，0.04%硫酸鎂。

此外，一方面，蛹蟲草就是一種退化特別快的菌種，如果培養基營養不全，就會導致產量低、退化快；另一方面，蛹蟲草的生長是一個退化的過程，是人工難以控制的。

為此，需要探索一種培育優良蛹蟲草菌種的方法，并為其生長提供營養全面的培養基，以期獲得有活力且退化慢的菌種，進而培育得到產量高、有益成分含量豐富的子實體。

技術實現要素：

本發明提供一種蛹蟲草多孢雜交育種的方法，包括以下步驟：

1）將蛹蟲草的孢子彈射至固體培養基上，培養得到蛹蟲草的多孢菌種；

2）將所述多孢菌種轉接到斜面培養基中，培養得到斜面菌種；

3）將所述斜面菌種轉接到液體培養基上，搖床培養得到種子液。

通過本發明獲得的蛹蟲草多孢雜交菌種活力高、發菌快，可減少菌種的退化，進一步培養可獲得高產、蟲草素含量高的子實體。

進一步，步驟1）所述的固體培養基按照重量份數計，包括：馬鈴薯9-10份，葡萄糖0.9-1份，瓊脂0.6-0.8份，水50-60份。

更進一步，步驟1）所述的固體培養基按照重量份數計，包括：馬鈴薯9.4份，葡萄糖0.95份，瓊脂0.7份，水56份。

進一步，步驟2）所述的斜面培養基按照重量份數計，包括：馬鈴薯9-10份，葡萄糖0.9-1份，磷酸二氫鉀0.09-0.1份，硫酸鎂0.04-0.05份，瓊脂0.8-1份，水50-60份。

更進一步，步驟2）所述的斜面培養基按照重量份數計，包括：馬鈴薯9.5份，葡萄糖0.93份，磷酸二氫鉀0.093份，硫酸鎂0.045份，瓊脂0.82份，水56。

進一步，步驟3）所述的液體培養基按照重量份數計，包括：馬鈴薯9-10份，葡萄糖0.9-1份，蛋白胨0.4-0.5份，酵母浸粉0.4-0.5份，磷酸二氫鉀0.09-0.1份，硫酸鎂0.04-0.05份，脫脂蠶蛹粉0.09-0.1份，水50-60份，維生素b10.0009-0.02份。

更進一步，步驟3）所述的液體培養基按照重量份數計，包括：馬鈴薯9.5份，葡萄糖0.96份，蛋白胨0.43份，酵母浸粉0.43份，磷酸二氫鉀0.093份，硫酸鎂0.047份，脫脂蠶蛹粉0.094份，水54份，維生素b10.0112份。

進一步，所述培養基中的蛋白胨的總氮含量不低于13.5%，氨基酸含量不低于3%；所述培養基中的水為礦泉水或者蒸餾水，ph值為6-7。

本發明使用的培養基為能夠為蛹蟲草菌種或子實體的生長提供全面營養的培養基，其可市售獲得，或者按照已有文獻自制。作為一種更優的實施方式，優選其含有本發明所列的培養基組成，這些培養基提供了最合適的碳氮比，營養較其他現有的培養基更為全面，使蛹蟲草在發菌過程中發菌快，穩定，減少了菌種的退化。

進一步，所述步驟1）在20-22℃培養2天。

進一步，所述步驟2）在20-22℃培養7-8天。

進一步，所述步驟3）在20-22℃下以200轉/分鐘搖床培養5-6天。

本發明還提供以上任一項所述的蛹蟲草多孢雜交育種的方法在蛹蟲草培養中的應用。

本發明提供一種培育蛹蟲草的方法，包括將以上任一項所述的蛹蟲草多孢雜交育種的方法制備的種子液接種到子實體培養基，繼續進行培養。

進一步，所述子實體培養基按照重量份數計，包括：大米和/或麥子25-35份，蛋白胨0.27份，磷酸二氫鉀0.096份，硫酸鎂0.096份，葡萄糖0.27份，水58份。

更進一步，所述子實體培養基按照重量份數計，包括：大米和/或麥子30份，蛋白胨0.27份，磷酸二氫鉀0.096份，硫酸鎂0.096份，葡萄糖0.27份，水58份。

進一步，子實體培養包括以下步驟：

4）將所述種子液接種到子實體培養基，避光培養，長出菌絲體；

5）將所述菌絲體轉色培養，得到長有原基的菌絲體；

6）將所述長有原基的菌絲體進行子實體培養，至采收。

進一步，所述步驟4）避光培養（例如置于暗培室中培養）的溫度為20-22℃，培養8-10天。

進一步，所述步驟5）轉色培養的溫度為20-22℃，濕度為70%，每天通風（例如置于通風房中培養）4-5小時，光照12-16小時，培養4-5天。

進一步，所述步驟6）子實體培養的溫度為20-25℃，培養35-40天。

具體實施方式

本發明提供的蛹蟲草為有性繁殖，遺傳性較好，孢子粉含量高、產量高，子實體粗壯品相好，其中含有的蟲草素及多糖在抗炎、抗癌及增強免疫力等方面起到重要作用。具體地，本發明比現有菌種的培育方法和傳統配方的培養基發菌快，污染率降低達15%，采收的子實體的蟲草素含量為1.5%-2%，比無性繁殖的草高20%，產量比無性繁殖的草高10%-15%。

在多孢雜交育種的過程中，不同生長階段的蛹蟲草菌種采取不同的培養基進行培養。其中，將孢子彈射到固體培養基上之后，通過一定時間的培養，得到多孢子種，再將得到的多孢子種轉接到斜面試管培養基中，通過培養一段時間后得到斜面菌種，再將斜面菌種轉接到液體培養液中，通過培養一段時間得到液體菌種，將液體菌種再轉接到子實體培養基中，并進行暗培養后就會得到菌絲體，菌絲體通過轉色培養以及子實體培養之后即可得到產量高、蟲草素高的子實體。通過以上描述可知，本發明提供的蛹蟲草多孢雜交育種的栽培方法，在培養過程中，蛹蟲草菌種在不同階段采取了不同的培養條件，通過不同的培養條件，控制了蛹蟲草菌種不同時期的生長特性，使得菌種能夠穩定、高效的繁殖和生長，因此其產量高，蟲草素含量大。

固體培養基、斜面試管培養基、液體培養液和子實體栽培培養基分別為蛹蟲草在不同的階段提供了不同的營養，進而確保菌種的生長活力和適應栽培的目標需求。每種培養基都是按照不同的營養成分按照優選的重量比例組合而成。固體培養基、斜面試管培養基、液體培養液和子實體栽培培養基主要以供應碳氮源的方式為蛹蟲草不同階段提供生長繁殖所需的營養。此外，在固體培養基中，葡萄糖和馬鈴薯為蛹蟲草提供了生長所需要的碳源；而斜面培養基中加入了磷酸二氫鉀，使酸堿度進行了緩沖，維持了更好的生長條件；接下來的液體培養液更全面為斜面菌種提供了營養物質，進而得到液體菌種再通過子實體培養基培養之后得到菌絲體；菌絲體轉色培養后得到產量高、蟲草素含量高的蛹蟲草子實體。由于四種培養基均含有提供蛹蟲草生長的碳源和氮源，因此培養基的營養會決定蛹蟲草后期的活性和蟲草素的形成。

在本發明中，液體培養基中添加蠶蛹粉可使菌種的遺傳性得以良好的保持，減少菌種在不同培養基中的退化。

各培養基的原料都經過嚴格篩選，如蠶蛹粉、蛋白胨、大米和小麥都要求質量過關，并有正規的生產廠家；馬鈴薯的采購更嚴格，要求無腐爛、無霉變、無發芽、無損傷、無綠變、完整無損傷的新鮮馬鈴薯，其蛋白質含量不低于3%，淀粉含量不低于13%-15%；蛋白胨的總氮含量不低于13.5%，氨基酸含量不低于3%；選用的大米和小麥都無異味、無雜質、無霉變、無蛀蟲，且淀粉含量不低于20%，蛋白質含量不低于3%-5%。

在一個具體的實施方案中，本發明提供一種蛹蟲草多孢雜交育種及培育蛹蟲草的方法，包括：分別配制固體培養基、斜面試管培養基、液體培養液和子實體栽培培養基；將蛹蟲草的孢子彈射到固體培養基上，并在20-22℃培養2天；再將固體培養基的菌種轉接到斜面試管培養基中，在20-22℃培養7-8天；將所述斜面菌種轉接到液體培養液中，在20-22℃下以200轉/分鐘搖床培養5-6天得到種子液；將所述種子液轉接到子實體培養基上，放置到暗培室避光培養8-10天，得到菌絲體；將菌絲體轉色，進行子實體培養，培育可得到高產、蟲草素含量高的子實體。

在一個更具體的實施方案中，所述固體培養基按照重量份數計，包括：馬鈴薯9.4份，葡萄糖0.95份，瓊脂0.7份，水56份；所述斜面培養基按照重量份數計，包括：馬鈴薯9.5份，葡萄糖0.93份，磷酸二氫鉀0.093份，硫酸鎂0.045份，瓊脂0.82份，水56份；所述液體培養基按照重量份數計，包括：馬鈴薯9.5份，葡萄糖0.96份，蛋白胨0.43份，酵母浸粉0.43份，磷酸二氫鉀0.093份，硫酸鎂0.047份，脫脂蠶蛹粉0.094份，水54份，維生素b10.0112份；所述子實體栽培培養基按照重量份數計，包括：大米和/或麥子30份，蛋白胨0.27份，磷酸二氫鉀0.096份，硫酸鎂0.096份，葡萄糖0.27份，水58份。

以下通過實施例對本發明作進一步詳細的說明，但這些內容不應理解為對本發明的限制。其中未具體載明的操作方法依照本領域的常規操作進行，使用的試劑、原料和菌種等均市售獲得。其中培養基的組分購自北京奧博星。

實施例

1）配制固體培養基，具體包括：稱取馬鈴薯200g，煮30min后濾掉殘渣，得到馬鈴薯液，將馬鈴薯液加水補至1190ml，然后分別加入20g葡萄糖、15g瓊脂粉，溶解攪拌均勻分裝在500l的三角瓶中，每瓶約90ml，將裝有液體的三角瓶放置滅菌，121℃滅菌30分鐘，然后取出待其凝固備用。

選取無菌培養的成熟的蛹蟲草2株，將蛹蟲草消毒，將消毒好的蟲草倒掛在固體培養基三角瓶中，在避光培養2天便可孢子彈落，落在培養基的孢子經過2天的培養即可得到固體多孢子菌種。

各培養基的配制嚴格控制質量和數量，例如馬鈴薯以200g最佳，為了使其有效的營養得到更好的釋放，應在制作過程中把馬鈴薯切成小塊，此外配制所需要的水為礦泉水，滅菌時溫度控制在121℃，滅菌時間不要超過30min。

2）配制斜面試管培養基，具體包括：稱取馬鈴薯200g，煮30min后濾掉殘渣，得到馬鈴薯液，將馬鈴薯液加水補至1180ml，然后分別加入葡萄糖19.6g、磷酸二氫鉀2.0g、硫酸鎂0.95g、瓊脂17.3g，溶解攪拌均勻分裝在試管中，將裝有液體的試管放置滅菌，121℃滅菌30分鐘，然后取出15°斜放待其凝固備用。

將試管放置超凈工作臺上消毒30分鐘，然后將固體多孢子菌種轉接至斜面試管培養基中，在21℃培養7天，即可得到斜面試管種。

3）配制液體培養液，具體包括：稱取馬鈴薯200g，煮30min后濾掉殘渣，得到馬鈴薯液，將馬鈴薯液加水補至1137ml，然后分別加入葡萄糖20g、蛋白胨9g、酵母浸粉9g、磷酸二氫鉀2.0g、硫酸鎂1.0g、脫脂蠶蛹粉2g、b10.24g，溶解攪拌均勻分裝在三角瓶中，將裝有液體的三角瓶放置滅菌，121℃滅菌30分鐘，然后取出放涼備用。其中，加入蠶蛹粉可使菌種的遺傳性得以良好的保持，減少菌種在不同培養基中的退化。

將液體培養液放置超凈工作臺上消毒30分鐘，然后將斜面試管菌種轉接至液體培養液中，在21℃下以200轉/分鐘搖床培養6天得到種子液。

4）配制子實體培養基，包括：小麥300g，加入蛋白胨2.7g、磷酸二氫鉀0.96g、硫酸鎂0.96g、葡萄糖2.7g，攪拌加入水580ml，高溫123℃滅菌50分鐘，放涼后備用。

將子實體培養基放入超凈工作臺滅菌30分鐘，然后將液體菌種轉接到子實體培養基中，放置到暗培室避光培養9天，培養溫度21℃，得到菌絲體。將菌絲體轉移至可通風的房間轉色，房間溫度為20℃，每天通風4小時，光照11小時，培養2-3天。暗培養及轉色的房間濕度控制在70%-80%，轉色之后培養基就會出現原基分化，出現小刺芽，這時再培養30天，溫度為20-22℃，即可得到高產的子實體。子實體長到約8-10cm，子實體表面有粉狀物形成時即可采收。

根據本實施例提供的多孢雜交育種法，采收子實體的蟲草素的平均含量為1.8%（由國家輕工業食品質量監督檢測天津站測得），比市售無性繁殖的草高20%，子實體產量比無性繁殖的草高15%。

以上所述僅為本發明的優選實施方案，并不用于限制本發明，對于本領域的科技人員本發明可以有更多改變和變化，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進均包含在本發明內。