本公開涉及病毒載體組合物，其在室溫下、冷藏和冷凍溫度下具有經改進的穩定性。更具體地，本公開涉及經改進的水性和冷凍液體病毒載體組合物，其在各種條件下儲存后顯示出高滴度恢復率、顆粒完整性和效力。

背景技術：

1、病毒載體已經出現為將治療性貨物遞送至靶細胞的顯著方式。此類載體包括源自腺病毒、腺相關病毒(aav)、單純皰疹病毒(hsv)和慢病毒的系統。這些載體能夠將所關注的基因(例如，治療性基因)引入和/或整合到靶細胞的基因組中。因此，靶細胞可以被理論地編輯以表達任何所關注的基因，這也可以具有治療益處。此類療法已進入診所中(參見例如，《當代基因療法(curr?gene?ther.)》2015；15(1):64-81和《血液評論(blood?rev.)》2022年1月21日；100929)，并且代表了治療某些疾病的變革性方法。

2、限制病毒載體在臨床環境(包括慢病毒)中的使用的一個因素是在高于和低于冷凍的溫度下儲存后低穩定性、聚集和病毒滴度的損失(參見例如，kumru等人,《藥理學科學雜志(j?pharm?sci.)》2018年11月；107(11):2764-2774)。實際上，病毒載體可以在制備、儲存和最終研究或商業使用期間經受各種各樣的溫度。病毒載體可以經受制備和轉導期間的生理溫度(例如，25℃和/或37℃)、純化和短期儲存期間的較冷的溫度(例如，2-8℃)以及長期儲存期間的冷凍溫度(例如，0℃或更低)。此外，病毒載體可以在其使用壽命和儲存期間經歷若干次凍融。

3、因此，仍然需要用于病毒載體的長期儲存的經改進的組合物。

技術實現思路

1、本公開總體上部分地涉及用于儲存病毒載體的經改進的組合物，所述病毒載體包括但不限于逆轉錄病毒載體或慢病毒載體。

2、一方面，提供了一種水性病毒組合物，其包含病毒載體、hepes或l-組氨酸緩沖液、碳水化合物和氨基酸。

3、另一方面，提供了一種水性病毒組合物，其中所述組合物包含病毒載體；hepes緩沖液；碳水化合物；鹽；和泊洛沙姆。

4、在各個實施例中，所述緩沖液以約25mm至約30mm、約26mm至約29mm、約27mm至約28mm或約27.5mm的濃度存在。在具體實施例中，所述緩沖液是hepes緩沖液。在具體實施例中，所述緩沖液是l-組氨酸緩沖液。

5、在各個實施例中，所述碳水化合物以約66mm至約80mm、約67mm至約79mm、約68mm至約78mm、約69mm至約77mm、約70mm至約76mm、約71mm至約75mm、約72mm至約74mm或約73mm的濃度存在。在各個實施例中，所述碳水化合物以所述組合物的每體積約2.0重量％至約3.0重量％、所述組合物的每體積約2.1重量％至約2.9重量％、所述組合物的每體積約2.2重量％至約2.8重量％、所述組合物的每體積約2.3重量％至約2.7重量％、所述組合物的每體積約2.4重量％至約2.6重量％或所述組合物的每體積約2.5重量％的濃度存在。在各個實施例中，所述碳水化合物是二糖。在各個實施例中，所述碳水化合物是乳糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖和/或甘油。在一些實施例中，所述碳水化合物是蔗糖和/或海藻糖。在具體實施例中，所述碳水化合物是蔗糖。在具體實施例中，所述碳水化合物是海藻糖。

6、在各個實施例中，所述氨基酸以約40mm至約60mm、約41mm至約59mm、約42mm至約58mm、約43mm至約57mm、約44mm至約56mm、約45mm至約55mm、約46mm至約54mm、約47mm至約53mm、約48mm至約52mm、約49mm至約51mm或約50mm的濃度存在。在一些實施例中，所述氨基酸是非極性氨基酸。在一些實施例中，所述氨基酸選自由以下組成的組：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。在一些實施例中，所述氨基酸選自由以下組成的組：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和脯氨酸。在具體實施例中，所述氨基酸是l-脯氨酸。

7、在各個實施例中，所述組合物進一步包含鹽。在一些實施例中，所述鹽以約65mm至約85mm、約66mm至約84mm、約67mm至約83mm、約68mm至約82mm、約69mm至約81mm、約70mm至約80mm、約71mm至約79mm、約72mm至約78mm、約73mm至約77mm、約74mm至約76mm、約75mm的濃度存在。在一些實施例中，所述鹽是氯鹽、kcl或nacl。在具體實施例中，所述鹽是nacl。

8、在各個實施例中，所述組合物進一步包含泊洛沙姆。在一些實施例中，所述泊洛沙姆以約0.01mg/ml至約1mg/ml、約0.02mg/ml至約0.9mg/ml、約0.03mg/ml至約0.8mg/ml、約0.04mg/ml至約0.7mg/ml、約0.05mg/ml至約0.6mg/ml、約0.06mg/ml至約0.5mg/ml、約0.07mg/ml至約0.4mg/ml、約0.08mg/ml至約0.3mg/ml、約0.09mg/ml至約0.2mg/ml、約0.1mg/ml至約0.8mg/ml、約0.1mg/ml至約0.5mg/ml或約0.2mg/ml至約0.4mg/ml的濃度存在。在某些實施例中，所述泊洛沙姆以約0.1mg/ml的濃度存在。在某些實施例中，所述泊洛沙姆以約0.3mg/ml的濃度存在。在一些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188、泊洛沙姆288、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338或泊洛沙姆407。在具體實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188(p188)。

9、在各個實施例中，所述組合物包含約6.5至約8的ph。在一些實施例中，所述組合物包含約6.5的ph。在一些實施例中，所述組合物包含約7的ph。在一些實施例中，所述組合物包含約7.5的ph。在一些實施例中，所述組合物包含約8的ph。

10、在具體實施例中，提供了一種水性病毒組合物，其中所述組合物包含病毒載體；約27.5mm?hepes；約73mm蔗糖或組合物的每體積約2.5重量％的蔗糖；以及約50mm?l-脯氨酸；其中所述組合物包含約7的ph。

11、在具體實施例中，提供了一種水性病毒組合物，其中所述組合物包含病毒載體；約27.5mm?l-組氨酸；約73mm蔗糖或組合物的每體積約2.5重量％的蔗糖；以及約50mm?l-脯氨酸；其中所述組合物包含約7的ph。

12、在具體實施例中，提供了一種水性病毒組合物，其中所述組合物包含病毒載體；約27.5mm?hepes；約73mm蔗糖或組合物的每體積約2.5重量％的蔗糖；約50mm?l-脯氨酸；以及約0.1至約0.8mg/ml泊洛沙姆188；其中所述組合物包含約7的ph。

13、在具體實施例中，提供了一種水性病毒組合物，其中所述組合物包含病毒載體；約27.5mm?hepes；約73mm蔗糖或組合物的每體積約2.5重量％的蔗糖；約50mm?l-脯氨酸；以及約0.3mg/ml泊洛沙姆188；其中所述組合物包含約7的ph。

14、在具體實施例中，提供了一種水性病毒組合物，其中所述組合物包含病毒載體；約27.5mm?hepes；約73mm蔗糖或組合物的每體積約2.5重量％的蔗糖；約50mm?l-脯氨酸；以及約75mm?nacl；其中所述組合物包含約7的ph。

15、在具體實施例中，提供了一種水性病毒組合物，其中所述組合物包含病毒載體；約27.5mm?hepes；約73mm蔗糖或組合物的每體積約2.5重量％的蔗糖；約50mm?l-脯氨酸；約75mm?nacl；以及約0.1至約0.8mg/ml泊洛沙姆188；其中所述組合物包含約7的ph。

16、在各個實施例中，所述組合物進一步包含鹽。在一些實施例中，所述鹽以約65mm至約85mm、約66mm至約84mm、約67mm至約83mm、約68mm至約82mm、約69mm至約81mm、約70mm至約80mm、約71mm至約79mm、約72mm至約78mm、約73mm至約77mm、約74mm至約76mm、約75mm的濃度存在。在具體實施例中，所述鹽是nacl。

17、在具體實施例中，提供了一種水性病毒組合物，其中所述組合物包含病毒載體；約27.5mm?hepes；組合物的每體積約2.5重量％的蔗糖；約75mm?nacl；以及約0.1至約0.8mg/ml泊洛沙姆188或組合物的每體積約0.01重量％至約0.08重量％泊洛沙姆188；其中所述組合物包含約7的ph。

18、在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，所述病毒載體以約1x108至約2x?109tu/ml的滴度存在。在各個實施例中，所述病毒載體以約1x?108tu/ml、約2x108tu/ml、約3x?108tu/ml、約4x?108tu/ml、約5x?108tu/ml、約6x?108tu/ml、約7x?108tu/ml、約8x?108tu/ml、約9x?108tu/ml、約1x?109tu/ml或約2x?109tu/ml的滴度存在。

19、在各個實施例中，所述載體是腺病毒載體、腺相關病毒(aav)載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體或逆轉錄病毒載體。在一些實施例中，所述病毒載體是慢病毒載體。在一些實施例中，所述慢病毒載體選自由以下組成的組：人類免疫缺陷病毒1(hiv-1)；人類免疫缺陷病毒2(hiv-2)、維斯納梅迪病毒(visna-maedi?virus，vmv)病毒；山羊關節炎-腦炎病毒(caev)；馬傳染性貧血病毒(eiav)；貓免疫缺陷病毒(fiv)；牛免疫缺陷病毒(biv)；以及猿猴免疫缺陷病毒(siv)。在一些實施例中，所述慢病毒載體源自人類免疫缺陷病毒-1(hiv-1)或人類免疫缺陷病毒2(hiv-2)。在具體實施例中，所述慢病毒載體源自人類免疫缺陷病毒-1(hiv-1)。

20、在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，所述病毒載體被假型化。在各個實施例中，所述病毒載體用來自水皰性口炎病毒的毒株的包膜蛋白進行假型化。在一些實施例中，所述水皰性口炎病毒的毒株選自由以下組成的組：印第安納株(indiana)、阿拉戈斯株(alagoas)、新澤西株(new?jersey)、伊斯法罕株(isfahan)、科卡爾株(cocal)、馬拉巴株(maraba)或皮里株(piry)。在具體實施例中，所述病毒載體用水皰性口炎病毒g(vsv-g)蛋白進行假型化。在一些實施例中，所述病毒載體用源自以下的包膜進行假型化：麻疹(measles)包膜蛋白、辛德畢斯(sindbis)包膜蛋白、麻疹病毒(morbillivirus)f蛋白和h蛋白、仙臺病毒(sendai)f蛋白和hn蛋白或副粘病毒科(paramyxoviridae)f蛋白和h蛋白。

21、在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，所述病毒載體包含多核苷酸，所述多核苷酸包含轉基因。在一些實施例中，所述轉基因編碼治療性蛋白。在一些實施例中，所述轉基因或治療性蛋白是嵌合抗原受體(car)、嵌合共刺激受體(ccr)、αβt細胞受體(αβ-tcr)、γδt細胞受體(γδ-tcr)、經二聚化劑調控的免疫受體復合物(daric)或開關受體。在一些實施例中，所述轉基因或治療性蛋白用于治療單基因疾病、病癥或病狀。在一些實施例中，所述轉基因或治療性蛋白是用于治療血紅蛋白病的治療性珠蛋白或用于治療cald的abcd1基因。

22、在具體實施例中，本文所設想的組合物不包含血清、人血清白蛋白(hsa)、pipes、檸檬酸鈉、磷酸鈉和/或tris。在一些實施例中，本文所設想的組合物不包含鹽。在一些實施例中，本文所設想的組合物不包含nacl。在一些實施例中，本文所設想的組合物不包含kcl。在一些實施例中，本文所設想的組合物不包含海藻糖。

23、在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，相對于在儲存或至少一次凍融循環之前所述組合物中的所述病毒載體的感染滴度，所述病毒載體在25℃下儲存24小時、在2-8℃下儲存48小時、在2-8℃下儲存168小時和/或至少1次凍融循環后維持在hos細胞中的大于約75％、約80％、約85％、約90％或約95％的感染滴度恢復率。

24、在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，所述病毒載體具有約56°至約62℃的熱展開溫度，如通過差示掃描熒光法(dsf)所測量的。

25、在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，所述病毒載體具有約58°至約60℃的熱展開溫度，如通過差示掃描熒光法(dsf)所測量的。

26、在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，相對于在儲存或至少一次凍融循環之前所述組合物中的所述病毒載體的流體動力學直徑，所述病毒載體維持約150nm至約170nm的流體動力學直徑，如通過在25℃以及0.967厘泊(cp)的粘度值下的動態光散射(dls)所測量的。

27、在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，與參考標準品相比，所述病毒載體在儲存后維持至少78％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％效力，如通過pbmc中的轉基因表達所測量的。

28、在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，所述組合物在儲存后不具有可見纖維顆粒(束狀纖維)。在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，所述組合物在儲存后具有5個或更少個可見顆粒或微粒。在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，所述組合物在儲存后具有4個或更少個可見顆粒或微粒。在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，所述組合物在儲存后具有3個或更少個可見顆粒或微粒。在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，所述組合物在儲存后具有2個或更少個可見顆粒或微粒。在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，所述組合物在儲存后具有1個或更少個可見顆粒或微粒。在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，所述組合物在儲存后不具有可見顆粒。

29、在各個實施例中，所述儲存是在25℃、2-8℃或37℃下。在一些實施例中，所述儲存持續24小時、48小時或72、96、120、144或168小時或更長時間。

30、在各個實施例中，所述儲存包含一次或多次凍融循環。在一些實施例中，所述一次或多次凍融循環是1、2、3、4或5次凍融循環。在一些實施例中，所述一次或多次凍融循環包含將所述組合物在約-65°或更低溫度下冷凍約1.5小時或更長時間，并且在30℃下解凍1.5小時。

31、在本文所設想的方面和實施例中的任何方面和實施例中，所述組合物被冷凍。

32、另一方面，提供了一種用于儲存病毒載體的方法，所述方法包含提供病毒載體，使所述病毒載體與本文所設想的組合物中的任何組合物接觸，以及在約25℃或更低溫度下儲存所述病毒組合物。

33、另一方面，提供了一種用于儲存病毒載體的方法，所述方法包含提供病毒載體，使所述病毒載體與本文所設想的組合物中的任何組合物接觸，以及將病毒組合物在約2-8℃或更低溫度下儲存至少約24小時。

34、另一方面，提供了一種用于冷凍保存病毒載體的方法，所述方法包含提供病毒載體，使所述病毒載體與本文所設想的組合物中的任一種組合物接觸，將病毒組合物冷凍，以及在約0℃或更低溫度下儲存所述病毒組合物。

35、在各個實施例中，本文所設想的方法包含將所述病毒組合物儲存至少約24小時、48小時、至少約72小時、至少約96小時、至少約120小時、至少約148小時或至少約168小時。

36、另一方面，提供了一種在細胞中表達轉基因的方法，所述方法包含使細胞與本文所設想的組合物中的任一種組合物接觸。在各個實施例中，所述細胞是哺乳動物細胞。在一些實施例中，所述細胞是造血細胞。在一些實施例中，所述細胞是造血干細胞或祖細胞。在一些實施例中，所述細胞是人cd34+造血細胞或祖細胞。在一些實施例中，所述細胞是t細胞。在一些實施例中，所述細胞是αβt細胞。在一些實施例中，所述細胞是γδt細胞。在一些實施例中，所述細胞是cd3+、cd4+和/或cd8+細胞。在一些實施例中，所述細胞是免疫效應細胞。在一些實施例中，所述細胞是細胞毒性t淋巴細胞(ctl)、腫瘤浸潤淋巴細胞(til)或輔助t細胞。在一些實施例中，所述細胞是自然殺傷(nk)細胞或自然殺傷t(nkt)細胞。