本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)，特別涉及一種促使間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

1、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte?precursor，ops)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中負(fù)責(zé)髓鞘的產(chǎn)生，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和運(yùn)作起關(guān)鍵作用，因各種原因?qū)е碌膐p或髓鞘損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育或功能異常的重要原因，會(huì)直接導(dǎo)致腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、小兒腦癱等嚴(yán)重疾病，同時(shí)和脊髓損傷、腦卒中等傷病的惡化有關(guān)，對(duì)人類(lèi)健康有重大威脅。既往的研究表明，移植op可以修復(fù)髓鞘，從根本治療腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、小兒腦癱等疾病，也可以顯著促進(jìn)脊髓損傷、腦卒中等傷病的康復(fù)，但op來(lái)源極為有限，限制了其臨床應(yīng)用。成體op的分離依賴于組織學(xué)部位，一般成年人體內(nèi)幾乎無(wú)法取材，而流產(chǎn)胎兒腦組織分離op受到倫理學(xué)限制，每批次腦組織樣本分離得到的op在質(zhì)量上不均一，影響治療效果。近些年來(lái)，對(duì)干細(xì)胞分化機(jī)制的研究取得了很大進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞均有少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化潛能，但胚胎干細(xì)胞的適用同樣受到倫理學(xué)限制，并且胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的工藝耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)100-200日、成本高、失敗幾率大、批次間質(zhì)量波動(dòng)大，不利成藥及臨床應(yīng)用(有關(guān)文獻(xiàn)及知識(shí)產(chǎn)權(quán)可參見(jiàn)自然-生物技術(shù)2022；紐約干細(xì)胞基金會(huì)有限公司-v·福薩蒂p·道瓦拉斯2017)。

2、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal?stem?cell，msc)可從脂肪、臍帶、骨髓等多種組織采集，是樣本資源最豐富的成體干細(xì)胞，是基于干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)的最有前景的種子細(xì)胞。目前應(yīng)用于間充質(zhì)干細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法極為有限，僅限于使用多種生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)msc先分化為神經(jīng)干細(xì)胞，再分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)法存在誘導(dǎo)效率低下，誘導(dǎo)周期長(zhǎng)，且批次間質(zhì)量波動(dòng)較大和產(chǎn)量低等缺點(diǎn)。因此，本領(lǐng)域還有必要開(kāi)發(fā)改進(jìn)的技術(shù)，來(lái)提高分化效率、提高少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的質(zhì)量和產(chǎn)量。

3、在發(fā)明人前期的研究中，通過(guò)以含有“少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化關(guān)鍵基因”的基因表達(dá)載體進(jìn)行處理，其后進(jìn)行分化培養(yǎng)15-25天，即可得到少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。但該分化時(shí)間仍然較長(zhǎng)，如何進(jìn)一步縮短分化培養(yǎng)時(shí)間并兼顧少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的產(chǎn)量和質(zhì)量仍有待發(fā)明人進(jìn)行進(jìn)一步研究和解決。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提出了一種促使msc分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法。具體為一種主要使用特定小分子化合物，對(duì)msc進(jìn)行分化誘導(dǎo)的方法，所述方法可以促使msc以較高效率分化成少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，在大幅縮短分化耗時(shí)同時(shí)，提高少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的質(zhì)量。

2、本發(fā)明首先提供一種促使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法，包括如下步驟：

3、(1)分離間充質(zhì)干細(xì)胞，原代培養(yǎng)；

4、(2)將原代培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細(xì)胞傳代接種于細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)表面，添加細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)行第一次傳代培養(yǎng)，所述細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)經(jīng)過(guò)“促進(jìn)細(xì)胞貼壁”處理；

5、(3)將第一次傳代培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細(xì)胞再次傳代接種于細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)表面，添加細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)行第二次傳代培養(yǎng)，所述細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)未經(jīng)過(guò)“促進(jìn)細(xì)胞貼壁”處理；

6、(4)對(duì)第二次傳代培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細(xì)胞再次傳代接種于細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)表面，首先以含有“促分化增殖小分子化合物”的“少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)基#1”進(jìn)行第一階段培養(yǎng)，其后更換為“少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)基#2”進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，獲得少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。所述細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)經(jīng)過(guò)“促進(jìn)細(xì)胞貼壁”以及“重組人層粘連蛋白”處理，所述“少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化培養(yǎng)基”為無(wú)動(dòng)物源性配方。

7、進(jìn)一步的，步驟(1)中所述的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于人類(lèi)。來(lái)源于人類(lèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞用于獲得人少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，可應(yīng)用于人髓鞘損傷性疾病的治療。

8、進(jìn)一步的，所述間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源包括骨髓、臍血、臍帶、胎盤(pán)和脂肪組織。所述組織都是人體容易獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的組織。

9、進(jìn)一步的，步驟(1)中所述的原代培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基、步驟(2)和(3)中所述的細(xì)胞培養(yǎng)基均為msc基礎(chǔ)培養(yǎng)基，成分為mem-alpha+5％人血小板提取物。

10、進(jìn)一步的，步驟(2)和(3)中的所述細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)為細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞工廠；步驟(4)中的所述細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)為細(xì)胞培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

11、進(jìn)一步的，步驟(4)中所述的間充質(zhì)干細(xì)胞起始密度為0.1×104/cm2～1.5×104/cm2。

12、進(jìn)一步的，步驟(4)所述的間充質(zhì)干細(xì)胞起始密度為1.0×104/cm2。

13、進(jìn)一步的，步驟(4)中所述的以含有“促分化增殖小分子化合物”的“少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)基#1”進(jìn)行第一階段培養(yǎng)的時(shí)間為小于等于4天，例如培養(yǎng)2～4天(48～96小時(shí))。

14、進(jìn)一步的，步驟(4)所述的含有“促分化增殖小分子化合物”的“少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)基#1”中，所述的“促分化增殖小分子化合物”包括ldn193189和sb431542。

15、進(jìn)一步的，所述ldn193189的濃度為25～250nm，sb431542的濃度為10～100nm。在我們前期的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，ldn193189和/或sb431542的濃度超出前述范圍時(shí)，均會(huì)導(dǎo)致效果變差甚至出現(xiàn)細(xì)胞死亡。更優(yōu)選ldn193189濃度為100nm，sb431542濃度為10nm。

16、進(jìn)一步的，所述步驟(4)中采用所述的“少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)基#2”進(jìn)行第二階段培養(yǎng)的時(shí)間為小于等于6天，例如培養(yǎng)4～6天(96～144小時(shí))。

17、進(jìn)一步的，步驟(4)中總的培養(yǎng)的時(shí)間為6～10天。

18、進(jìn)一步的，步驟(4)中總的培養(yǎng)的時(shí)間為8天。

19、綜上，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明達(dá)到了以下技術(shù)效果：

20、1.本發(fā)明的方法效率高、耗時(shí)明顯較短，10天甚至小于10天就可得到少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。

21、2.本發(fā)明的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化方法避免了現(xiàn)有技術(shù)常用的基因編輯，避免了包括脫靶在內(nèi)的基因損傷風(fēng)險(xiǎn)，并且不使用包括病毒在內(nèi)的各類(lèi)載體，使得產(chǎn)物更純，安全性更高。

22、3.本發(fā)明的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化方法不使用動(dòng)物來(lái)源或人血液來(lái)源材料，使得產(chǎn)物更純，安全性更高。

23、4.本發(fā)明的方法獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞具有穩(wěn)定表型以及生成髓鞘的能力。

24、5.本發(fā)明的制備方法得到的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞可以用于治療各類(lèi)髓鞘損傷相關(guān)疾病。

技術(shù)特征：

1.一種促使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟(1)中所述的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于人類(lèi)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的促使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源包括骨髓、臍血、臍帶、胎盤(pán)和脂肪組織。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟(2)和(3)中的所述細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)為細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞工廠；步驟(4)中的所述細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)為細(xì)胞培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的間充質(zhì)干細(xì)胞起始密度為0.1×104/cm2～1.5×104/cm2。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的間充質(zhì)干細(xì)胞起始密度為1.0×104/cm2。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的以含有“促分化增殖小分子化合物”的“少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)基#1”進(jìn)行第一階段培養(yǎng)的時(shí)間為小于等于4天。

8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的“促分化增殖小分子化合物”包括ldn193189、sb431542。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述ldn193189的濃度為25～250nm，sb431542的濃度為10～100nm。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中采用所述的“少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)基#2”進(jìn)行第二階段培養(yǎng)的時(shí)間為小于等于6天。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種促使間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法，包括將分離的MSC原代培養(yǎng)、二次傳代培養(yǎng)后，以含有“促分化增殖小分子化合物”的“少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)基#1”進(jìn)行第一階段培養(yǎng)，再采用“少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)基#2”進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，獲得較高純度的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò)特定細(xì)胞分化處理和培養(yǎng)工藝，使用經(jīng)過(guò)重組人層粘連蛋白處理的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，對(duì)MSC進(jìn)行培養(yǎng)，促使其分化、增殖，在較短時(shí)間內(nèi)獲得MSC來(lái)源少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。相較于傳統(tǒng)IPSC需要100?200日的誘導(dǎo)培養(yǎng)，本發(fā)明可以在8?10天的短時(shí)間內(nèi)收獲純度較高的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，用于生產(chǎn)細(xì)胞治療產(chǎn)品。

技術(shù)研發(fā)人員：林楷,胡立基,徐軼冰
受保護(hù)的技術(shù)使用者：林楷
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28