本發明涉及腫瘤免疫治療，尤其涉及嵌合細胞因子受體基因修飾增強型細胞治療模型及其構建方法與應用。

背景技術：

1、過繼性細胞療法，是腫瘤免疫治療的重要方向之一，是將自體或異體的免疫細胞分離，經體外激活或基因修飾后，擴增出足夠量的抗腫瘤活性的免疫細胞，回輸給腫瘤患者，放大患者體內的細胞免疫功能以提高抗腫瘤效果的治療方法。

2、近年來，過繼行細胞療法在腫瘤治療中的應用取得令人矚目的進展，例如，嵌合抗原受體t細胞(car-t)療法在血液系統腫瘤治療中取得巨大進展。另一種基因修飾過繼性t細胞治療技術是tcr-t細胞(t?cellreceptor?engineered?t?cells)治療技術，是當前過繼性細胞治療的研究熱點之一，是指向普通t細胞中引入新的t細胞受體(t?cellreceptor,tcr)基因，使得改造后的t細胞能夠表達有效識別腫瘤細胞的tcr，從而引導t細胞殺傷腫瘤細胞。不同的t細胞對應的t細胞受體具有多樣性，可識別的腫瘤靶抗原種類比car-t細胞療法更多，在實體瘤中具有更廣闊的應用前景，有望成為實體瘤活細胞藥物的重要突破口。

3、目前在實體瘤中研究和應用較為廣泛的tcr-t細胞類型是靶向ny-eso-1的tcr-t細胞治療技術，多項臨床前研究已證實靶向ny-eso-1的tcr-t細胞可特異性靶向殺傷黑色素瘤、腦膠質瘤、非小細胞肺癌等多瘤種細胞系，最新臨床試驗數據也發現該tcr-t細胞療法在多發性骨髓瘤、黑色素瘤及滑膜肉瘤患者中都表現出良好的客觀反應率。

4、盡管tcr-t細胞治療技術已在惡性腫瘤類型中取得了進展，但在大部分實體瘤總的治療仍存在諸多問題，如實體瘤中抑制性免疫微環境對t細胞的抑制，t細胞在體內增殖存活能力較弱等，使得tcr-t細胞的實體瘤中的抗腫瘤療效仍然有限。

技術實現思路

1、有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供嵌合細胞因子基因修飾增強型tcr-t模型及其構建方法與應用。

2、本發明基于ny-eso-1特異性tcr-t細胞為模型，開發一種全新的嵌合細胞因子基因修飾的增強型tcr-t細胞。在ny-eso-1特異性tcr-t細胞的設計中引入嵌合細胞因子受體，不僅能解除這些t細胞在腫瘤免疫微環境中抑制，同時能扭轉tcr-t細胞的抑制信號為激活信號，增加t細胞的活性和持久性，增強tcr-t細胞對分泌il4的實體瘤的殺傷能力，提高tcr-t細胞療法的抗腫瘤療效。同時，建立對該tcr-t細胞增強功能的定性定量評價體系。本發明的t細胞也將擴展tcr-t細胞在制備預防和治療癌癥的活細胞藥物中的應用。

3、本發明的嵌合細胞因子受體包括胞外區、跨膜區和胞內區；

4、所述胞外區來自il4r，

5、所述跨膜區來自il2r、il7r或il21r等激活型細胞因子受體；

6、所述胞內區來自il2r、il7r或il21r等激活型細胞因子受體；

7、一些實施例中，所述嵌合細胞因子受體，自n端至c端依次為il4r胞外區、il7r跨膜區和il7r胞內區。

8、其中：

9、il4r胞外區為人源il4r胞外區，作為優選，其具有如seq?id?no:1所示的氨基酸序列，或者具有在如seq?id?no:1所示氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸形成的氨基酸序列，或者為與如seq?id?no:1所示氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。

10、metglytrpleucysserglyleuleupheprovalsercysleuvalleuleuglnvalalaserserglyasnmetlysvalleuglngluprothrcysvalserasptyrmetserileserthrcysglutrplysmetasnglyprothrasncysserthrgluleuargleuleutyrglnleuvalpheleuleuserglualahisthrcysileprogluasnasnglyglyalaglycysvalcyshisleuleumetaspaspvalvalseralaaspasntyrthrleuaspleutrpalaglyglnglnleuleutrplysglyserphelysprosergluhisvallysproargalaproglyasnleuthrvalhisthrasnvalseraspthrleuleuleuthrtrpserasnprotyrproproaspasntyrleutyrasnhisleuthrtyralavalasniletrpsergluasnaspproalaasppheargiletyrasnvalthrtyrleugluproserleuargilealaalaserthrleulysserglyilesertyrargalaargvalargalatrpalaglncystyrasnthrthrtrpserglutrpserproserthrlystrphisasnsertyrarggluprophegluglnhis(seq?id?no:1)。il7r跨膜區為人源il7r跨膜區，作為優選，其具有如seq?id?no:2所示的氨基酸序列，或者具有在如seq?id?no:2所示氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸形成的氨基酸序列，或者為與如seq?id?no:2所示氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。

11、proileleuleuthrileserileleuserphepheservalalaleuleuvalileleualacysvalleutrp(se?q?id?no:2)。

12、il7r胞內區為人源il7r胞內區，作為優選，其具有如seq?id?no:3所示的氨基酸序列，或者具有在如seq?id?no:3所示氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸形成的氨基酸序列，或者為與如seq?id?no:3所示氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列；

13、lyslysargilelysproilevaltrpproserleuproasphislyslysthrleugluhisleucyslyslysproarglysasnleuasnvalserpheasnprogluserpheleuaspcysglnilehisargvalaspaspileglnalaargaspgluvalgluglypheleuglnaspthrpheproglnglnleuglugluserglulysglnargleuglyglyaspvalglnserproasncysprosergluaspvalvalilethrprogluserpheglyargaspserserleuthrcysleualaglyasnvalseralacysaspalaproileleuserserserargserleuaspcysarggluserglylysasnglyprohisvaltyrglnaspleuleuleuserleuglythrthrasnserthrleupropropropheserleuglnserglyileleuthrleuasnprovalalaglnglyglnproileleuthrserleuglyserasnglngluglualatyrvalthrmetserserphetyrglnasngln(seq?id?no:3)。一些具體實施例中，所述嵌合細胞因子受體，自n端至c端依次為人源il4r胞外區、人源il7r跨膜區和人源il7r胞內區。

14、一個具體實施例中，所述嵌合細胞因子受體的氨基酸序列為：

15、metglytrpleucysserglyleuleupheprovalsercysleuvalleuleuglnvalalaserserglyasnmetlysvalleuglngluprothrcysvalserasptyrmetserileserthrcysglutrplysmetasnglyprothrasncysserthrgluleuargleuleutyrglnleuvalpheleuleuserglualahisthrcysileprogluasnasnglyglyalaglycysvalcyshisleuleumetaspaspvalvalseralaaspasntyrthrleuaspleutrpalaglyglnglnleuleutrplysglyserphelysprosergluhisvallysproargalaproglyasnleuthrvalhisthrasnvalseraspthrleuleuleuthrtrpserasnprotyrproproaspasntyrleutyrasnhisleuthrtyralavalasniletrpsergluasnaspproalaasppheargiletyrasnvalthrtyrleugluproserleuargilealaalaserthrleulysserglyilesertyrargalaargvalargalatrpalaglncystyrasnthrthrtrpserglutrpserproserthrlystrphisasnsertyrarggluprophegluglnhisproileleuleuthrileserileleuserphepheservalalaleuleuvalileleualacysvalleutrplyslysargilelysproilevaltrpproserleuproasphislyslysthrleugluhisleucyslyslysproarglysasnleuasnvalserpheasnprogluserpheleuaspcysglnilehisargvalaspaspileglnalaargaspgluvalgluglypheleuglnaspthrpheproglnglnleuglugluserglulysglnargleuglyglyaspvalglnserproasncysprosergluaspvalvalilethrprogluserpheglyargaspserserleuthrcysleualaglyasnvalseralacysaspalaproileleuserserserargserleuaspcysarggluserglylysasnglyprohisvaltyrglnaspleuleuleuserleuglythrthrasnserthrleupropropropheserleuglnserglyileleuthrleuasnprovalalaglnglyglnproileleuthrserleuglyserasnglngluglualatyrvalthrmetserserphetyrglnasngln(seqid?no:15)。

16、生物材料a，其包括如下i)～vi)中至少一種：

17、i)、如前所述的嵌合細胞因子受體；

18、ii)、編碼i)所述嵌合細胞因子受體的核酸；

19、iii)、表達單元，其包括啟動子和ii)所述的核酸；

20、iv)、載體，其包括ii)所述的核酸或iii)所述的表達單元。

21、v)、載體組合，其包括病毒包裝質粒和iv)所述的載體；

22、vi)、轉化體，其表達i)所述的嵌合細胞因子受體，或基因組中整合有ii)所述的核酸或iii)所述的表達單元，或轉化或轉染有含有iv)所述載體。

23、一些實施例中，所述核酸中：

24、編碼il4r胞外區的核酸具有如seq?id?no:4所示的核苷酸序列，或者具有在如seqid?no:4所示核苷酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個核苷酸且編碼il4r胞外區的核酸，或者為與如seq?id?no:4所示核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列；或者為與如前所述序列部分互補或完全互補的核酸；

25、atgggctggctgtgtagcggcctgctgttccccgtgtcctgcctggtgctgctgcaggtggcctctagcggaaatatgaaagtgctgcaggagccaacatgtgtgtccgactacatgagcatcagcacctgtgaatggaagatgaacggccctaccaactgcagcacagagctgcggctgctgtaccagctggttttcctgctgtccgaggcgcacacctgcatccctgagaacaacggaggcgccggctgcgtgtgccacctgctgatggacgacgtggtgtccgccgacaactacaccctggacctgtgggctggccagcaactgctgtggaagggcagcttcaaacctagcgagcacgtgaagcctagagcccctggcaatctgaccgtgcacaccaatgtgtctgataccctgctgctgacatggtccaacccctaccctcccgataactacctgtataaccacctgacatacgccgtgaacatctggagcgaaaacgaccccgccgatttcagaatctacaacgtgacctatctggaaccttccctgagaatcgccgctagcacactgaagagcggcatcagctacagagctagagtgcgggcttgggcccagtgctacaacaccacctggagcgaatggtctccttctaccaagtggcacaacagctaccgggaacccttcgagcagcat(seq?id?no:4)。

26、編碼il7r跨膜區的核酸具有如seq?id?no:5所示的核苷酸序列，或者具有在如seqid?no:5所示核苷酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個核苷酸且編碼il7r跨膜區的核酸，或者為與如seq?id?no:5所示核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列；或者為與如前所述序列部分互補或完全互補的核酸；

27、cctatcttgttgacaatctctatcctctcctttttcagcgtggccctgctggtgatcctggcctgtgtgctgtgg(seq?id?no:5)。

28、編碼il7r胞內區的核酸具有如seq?id?no:6所示的核苷酸序列，或者具有在如seqid?no:6所示核苷酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個核苷酸且編碼il7r胞內區的核酸，或者為與如seq?id?no:6所示核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列；或者為與如前所述序列部分互補或完全互補的核酸；

29、aaaaagcggatcaagcccattgtctggcctagtctccccgaccacaagaaaaccctggaacacctgtgcaagaagcctagaaagaacctgaacgtatctttcaaccccgagagcttcctggactgccagatccacagagtggacgatatccaggccagggacgaggtggaaggcttcctgcaggatacatttcctcagcagctggaagagtctgaaaagcagcggctgggcggcgacgtgcagagcccaaactgccctagcgaggacgtggtgatcaccccagagagcttcggcagagatagctccctgacctgcctggccggaaacgtcagcgcctgtgacgcccctattctgagcagcagcagaagcctggattgcagagagagcggcaagaatggcccccacgtgtaccaagacctgcttctgtctctgggtacaaccaactctaccctgcctccaccttttagcctgcaaagcggaatcctgaccctgaaccctgttgcccagggccaacctatcctgacaagcctgggcagcaatcaggaggaggcctacgtgaccatgagctctttctaccagaaccagtga(seq?id?no:6)。

30、所述表達單元由5’端至3’端依次為：啟動子、kozak序列、編碼胞外區的核酸、編碼跨膜區的核酸和編碼胞內區的核酸；作為優選，所述啟動子為ef1αpromoter、mscvpromoter或cmv?promoter。

31、所述載體的骨架載體為慢病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。

32、一些實施例中，所述骨架載體為慢病毒載體。具體實施例中，所述骨架載體為pcdh系列、plenti系列、plvx系列等。

33、一些實施例中，所述轉化體的宿主為t細胞、nk細胞、巨噬細胞、car-t細胞或tcr-t細胞。

34、本發明還提供了ny-eso-1靶向的tcr片段，其包括ny-eso-1特異性的tcrβ鏈可變區、tcrβ鏈恒定區、linker、ny-eso-1特異性的tcrα鏈可變區及tcrα鏈恒定區。

35、其中，所述linker選自：furin-linker-spacer-f2a、p2a，t2a或e2a等。

36、一些實施例中，所述ny-eso-1靶向的tcr片段，自n端至c端依次為：ny-eso-1特異性的tcrβ鏈可變區、tcrβ鏈恒定區、linker、ny-eso-1特異性的tcrα鏈可變區及tcrα鏈恒定區；

37、其中：

38、所述ny-eso-1特異性的tcrβ鏈可變區為人源ny-eso-1特異性的tcrβ鏈可變區，作為優選，其具有如seq?id?no:7所示的氨基酸序列，或者具有在如seq?id?no:7所示氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸形成的氨基酸序列，或者為與如seq?idno:7所示氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列；

39、metserileglyleuleucyscysalaalaleuserleuleutrpalaglyprovalasnalaglyvalthrglnthrprolyspheglnvalleulysthrglyglnsermetthrleuglncysalaglnaspmetasnhisglutyrmetsertrptyrargglnaspproglymetglyleuargleuilehistyrservalglyalaglyilethraspglnglygluvalproasnglytyrasnvalserargserthrthrgluasppheproleuargleuleuseralaalaproserglnthrservaltyrphecysalasersertyrvalglyasnthrglygluleuphepheglygluglyserargleuthrvalleu(seq?id?no:7)。

40、所述tcrβ鏈恒定區為鼠源tcrβ鏈恒定區，作為優選，其具有如seq?id?no:8所示的氨基酸序列，或者具有在如seq?id?no:8所示氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸形成的氨基酸序列，或者為與如seq?id?no:8所示氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列；

41、gluaspleuargasnvalthrproprolysvalserleuphegluproserlysalagluilealaasnlysglnlysalathrleuvalcysleualaargglyphepheproasphisvalgluleusertrptrpvalasnglylysgluvalhisserglyvalcysthraspproglnalatyrlysgluserasntyrsertyrcysleuserserargleuargvalseralathrphetrphisasnproargasnhispheargcysglnvalglnphehisglyleuserglugluasplystrpprogluglyserprolysprovalthrglnasnileseralaglualatrpglyargalaaspcysglyilethrseralasertyrglnglnglyvalleuseralathrileleutyrgluileleuleuglylysalathrleutyralavalleuvalserthrleuvalvalmetalametvallysarglysasnser(seqid?no:8)。

42、ny-eso-1特異性的tcrα鏈可變區為人源ny-eso-1特異性的tcrα鏈可變區，作為優選，其具有如seq?id?no:9所示的氨基酸序列，或者具有在如seq?id?no:9所示氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸形成的氨基酸序列，或者為與如seq?id?no:9所示氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列；

43、metgluthrleuleuglyleuleuileleutrpleuglnleuglntrpvalserserlysglngluvalthrglnileproalaalaleuservalprogluglygluasnleuvalleuasncysserphethraspseralailetyrasnleuglntrppheargglnaspproglylysglyleuthrserleuleuleuileglnserserglnarggluglnthrserglyargleuasnalaserleuasplysserserglyargserthrleutyrilealaalaserglnproglyaspseralathrtyrleucysalavalargproleutyrglyglysertyrileprothrpheglyargglythrserleuilevalhispro(seq?id?no:9)。

44、所述tcrα鏈恒定區為鼠源tcrα鏈恒定區，作為優選，其具有如seq?id?no:10所示的氨基酸序列，或者具有在如seq?id?no:10所示氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸形成的氨基酸序列，或者為與如seq?id?no:10所示氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列；

45、leuserglyglyproglnserglnserhisglnglnilelysproserhisleuglnglnglnaspproglnhisaspaspglnglnvalleulysileglnvalhisvalcysleuglualaleuleucysglnglyglyilethrglyhisvalargglytrpilecysglyvalcysleuleulysaspileleualacysgluargglyleuileglyproglyaspglyalavalglyleualavalhisglyleuhisvalglnhisalaleuvalcysasplysglyalaargleuhisglyleuglyhisvalaspleuglyilelysvalcysgluglnalaglnglyglyileleualaprotrpvalleuglnleuvalhisglyargleuargileleuaspvaltrpserargileleuleuhisvalalacysleuleuglnglnarggluileglyglyalaargalaalaproleucyspro(seq?id?no:10)。

46、一些具體實施例中，所述ny-eso-1靶向的tcr片段，自n端至c端依次為：人源ny-eso-1特異性的tcrβ鏈可變區、鼠源tcrβ鏈恒定區、furin-linker-spacer-f2a、人源ny-eso-1特異性的tcrα鏈可變區及鼠源tcrα鏈恒定區。其氨基酸序列為：

47、metserileglyleuleucyscysalaalaleuserleuleutrpalaglyprovalasnalaglyvalthrglnthrprolyspheglnvalleulysthrglyglnsermetthrleuglncysalaglnaspmetasnhisglutyrmetsertrptyrargglnaspproglymetglyleuargleuilehistyrservalglyalaglyilethraspglnglygluvalproasnglytyrasnvalserargserthrthrgluasppheproleuargleuleuseralaalaproserglnthrservaltyrphecysalasersertyrvalglyasnthrglygluleuphepheglygluglyserargleuthrvalleugluaspleuargasnvalthrproprolysvalserleuphegluproserlysalagluilealaasnlysglnlysalathrleuvalcysleualaargglyphepheproasphisvalgluleusertrptrpvalasnglylysgluvalhisserglyvalcysthraspproglnalatyrlysgluserasntyrsertyrcysleuserserargleuargvalseralathrphetrphisasnproargasnhispheargcysglnvalglnphehisglyleuserglugluasplystrpprogluglyserprolysprovalthrglnasnileseralaglualatrpglyargalaaspcysglyilethrseralasertyrglnglnglyvalleuseralathrileleutyrgluileleuleuglylysalathrleutyralavalleuvalserthrleuvalvalmetalametvallysarglysasnserargalalysargserglyserglyalathrasnpheserleuleulysglnalaglyaspvalglugluasnproglyprometgluthrleuleuglyleuleuileleutrpleuglnleuglntrpvalserserlysglngluvalthrglnileproalaalaleuservalprogluglygluasnleuvalleuasncysserphethraspseralailetyrasnleuglntrppheargglnaspproglylysglyleuthrserleuleuleuileglnserserglnarggluglnthrserglyargleuasnalaserleuasplysserserglyargserthrleutyrilealaalaserglnproglyaspseralathrtyrleucysalavalargproleutyrglyglysertyrileprothrpheglyargglythrserleuilevalhisproleuserglyglyproglnserglnserhisglnglnilelysproserhisleuglnglnglnaspproglnhisaspaspglnglnvalleulysileglnvalhisvalcysleuglualaleuleucysglnglyglyilethrglyhisvalargglytrpilecysglyvalcysleuleulysaspileleualacysgluargglyleuileglyproglyaspglyalavalglyleualavalhisglyleuhisvalglnhisalaleuvalcysasplysglyalaargleuhisglyleuglyhisvalaspleuglyilelysvalcysgluglnalaglnglyglyileleualaprotrpvalleuglnleuvalhisglyargleuargileleuaspvaltrpserargileleuleuhisvalalacysleuleuglnglnarggluileglyglyalaargalaalaproleucyspro(seq?id?no:16)。

48、本發明還提供了生物材料b，其包括如下i)～vi)中至少一種：

49、i)、ny-eso-1靶向的tcr片段

50、ii)、編碼i)所述tcr片段的核酸；

51、iii)、表達單元，其包括啟動子和ii)所述的核酸；

52、iv)、載體，其包括ii)所述的核酸或iii)所述的表達單元；

53、v)、載體組合，其包括病毒包裝質粒和iv)所述的載體；

54、vi)、轉化體，其表達i)所述的tcr片段，或基因組中整合有ii)所述的核酸或iii)所述的表達單元，或轉化或轉染有含有iv)所述載體。

55、所述核酸中：

56、編碼ny-eso-1特異性的tcrβ鏈可變區的核酸具有如seq?id?no:11所示的核苷酸序列，或者具有在如seq?id?no:11所示核苷酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個核苷酸且編碼ny-eso-1特異性的tcrβ鏈可變區的核酸，或者為與如seq?id?no:11所示核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列；或者為與如前所述序列部分互補或完全互補的核酸；

57、atgtccatcgggctgctgtgctgtgctgctctgtccctgctgtgggctgggcctgtcaatgctggggtcactcagactcctaagttccaggtgctgaagaccggccagagcatgacactgcagtgcgcccaggatatgaaccacgagtacatgtcctggtatcggcaggacccaggcatgggcctgagactgatccactacagcgtgggagcaggaatcaccgatcagggagaggtgcccaacggctataatgtgagccggtccaccacagaggacttcccactgagactgctgagcgccgcaccttctcagaccagcgtgtacttttgcgccagctcctatgtgggcaatacaggcgagctgttctttggagagggctccaggctgaccgtgctg(seq?id?no:11)。

58、編碼tcrβ鏈恒定區的核酸具有如seq?id?no:12所示的核苷酸序列，或者具有在如seq?id?no:12所示核苷酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個核苷酸且編碼tcrβ鏈恒定區的核酸，或者為與如seq?id?no:12所示核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列；或者為與如前所述序列部分互補或完全互補的核酸；

59、gaggatctgcgcaacgtgacaccccctaaggtgagcctgttcgagccttccaaggccgagatcgccaataagcagaaggccaccctggtgtgcctggccagaggcttctttccagatcacgtggagctgagctggtgggtgaacggcaaggaggtgcactccggcgtgtgcaccgacccacaggcctacaaggagtccaattactcttattgtctgtctagccggctgagagtgagcgccacattttggcacaacccccggaatcacttcagatgccaggtgcagtttcacggcctgagcgaggaggataagtggcctgagggctccccaaagccagtgacccagaacatctctgccgaggcatggggaagggcagactgtggaatcacctctgccagctatcagcagggcgtgctgtccgccacaatcctgtacgagatcctgctgggcaaggccaccctgtatgccgtgctggtgagcaccctggtggtcatggccatggtgaagcgcaagaactcc(seqid?no:12)。

60、編碼ny-eso-1特異性的tcrα鏈可變區的核酸具有如seq?id?no:13所示的核苷酸序列，或者具有在如seq?id?no:13所示核苷酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個核苷酸且編碼ny-eso-1特異性的tcrα鏈可變區的核酸，或者為與如seq?id?no:13所示核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列；或者為與如前所述序列部分互補或完全互補的核酸；

61、atggagacactgctgggcctgctgatcctgtggctgcagctgcagtgggtgtcctctaagcaggaggtgacccagatccctgccgccctgagcgtgccagagggagagaacctggtgctgaattgctctttcacagatagcgccatctacaacctgcagtggtttcggcaggaccctggcaagggcctgacctctctgctgctgatccagagctcccagagggagcagacatccggccgcctgaatgcctctctggataagtctagcggcagatccaccctgtacatcgcagcatctcagccaggcgacagcgccacatacctgtgcgccgtgaggccactgtacggaggatcttatatccccaccttcggcaggggcacaagcctgatcgtgcaccct(seq?id?no:13)。

62、編碼tcrα鏈恒定區的核酸具有如seq?id?no:14所示的核苷酸序列，或者具有在如seq?id?no:14所示核苷酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個核苷酸且編碼tcrα鏈恒定區的核酸，或者為與如seq?id?no:14所示核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列；或者為與如前所述序列部分互補或完全互補的核酸；

63、ttatcaggaggaccacagtctcagagtcatcagcagattaaacccagccaccttcagcagcaggatccgcagcacgatgaccagcaggttctgaaaattcaggttcatgtctgtctcgaagctcttctctgtcagggtggcatcacagggcacgtcagaggatggatatgtggcgtttgtctccttaaagatatcctggcatgtgaaagaggtctgattggaccaggcgatggcgccgttggacttgctgtccatggccttcatgtccagcacgcacttgtctgtgataaaggtgccagactccatggtcttgggcacgttgatctgggaatcaaagtctgtgaacaggcacagggtggaatcctggctccgtgggtccttcagctggtacacggcaggctccggattctggatgtttggtccaggattctcctccacgtcgcctgcctgcttcagcagagagaaattggtggcgccagagccgctccgctttgcccttga(seq?id?no:14)

64、所述表達單元由5’端至3’端依次為：啟動子、kozak序列、編碼ny-eso-1特異性的tcrβ鏈可變區的核酸、編碼tcrβ鏈恒定區的核酸、編碼linker的核酸、編碼ny-eso-1特異性的tcrα鏈可變區的核酸及編碼tcrα鏈恒定區的核酸；作為優選，所述啟動子為ef1αpromoter、、mscv?promoter或cmv?promoter。

65、一些實施例中，所述載體的骨架載體為慢病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。

66、一些實施例中，所述骨架載體為慢病毒載體。具體實施例中，所述骨架載體為pcdh系列、plenti系列、plvx系列等。

67、一些實施例中，所述轉化體的宿主為t細胞、nk細胞、巨噬細胞、car-t細胞或tcr-t細胞。

68、進一步的，本發明還提供了一種tcr-t細胞，其表達如前所述的ny-eso-1靶向的tcr片段，或基因組中整合有如前所述的核酸或表達單元，或轉化或轉染如前所述的載體。

69、更進一步的，本發明還提供了tcr-t細胞的構建方法，其包括：

70、使宿主表達如前所述的ny-eso-1靶向的tcr片段；

71、或使宿主基因組中整合有如前所述的核酸或表達單元；

72、或使宿主轉化或轉染如前所述的載體。

73、更進一步的，本發明還提供了另一種tcr-t細胞，其表達如前所述的ny-eso-1靶向的tcr片段，或基因組中整合有如前所述的核酸或表達單元，或轉化或轉染如前所述的載體，并且，其表達如前所述的嵌合細胞因子受體片段，或基因組中整合有如前所述的核酸或表達單元，或轉化或轉染有如前所述的載體。所述轉化或轉染的方式包括但不限于慢病毒、腺病毒，腺相關病毒、電轉、化學轉染法等過表達方法。

74、更進一步的，本發明還提供了所述tcr-t細胞的構建方法，其包括：

75、使宿主表達如前所述的ny-eso-1靶向的tcr片段，和如前所述的嵌合細胞因子受體；

76、或使宿主基因組中整合有如前所述的核酸或表達單元，和如前所述的核酸或表達單元；

77、或使宿主轉化或轉染如前所述的載體，和如前所述的載體。

78、所述轉化或轉染的方式包括但不限于慢病毒、腺病毒，腺相關病毒、電轉、化學轉染法等過表達方法。

79、更進一步的，本發明還提供了如下用途中的至少一項：

80、a)、il4抗體和/或il4r抗體在制備提高tcr-t等細胞活性的藥物中的應用；

81、b)、如前所述的生物材料，在提高tcr-t等細胞活性中的應用；

82、c)、如前所述的生物材料在制備治療腫瘤的藥物中的應用；

83、d)、如前所述的tcr-t等細胞細胞在制備治療腫瘤的藥物中的應用；

84、e)、如前所述制備方法制得的tcr-t等細胞細胞在制備治療腫瘤的藥物中的應用。

85、本發明中，所述提高tcr-t等細胞活性包括：解除il4對tcr-t等細胞的抑制，增強tcr-t等細胞的增殖能力和/或增強對tcr-t等細胞對il4陽性腫瘤的抗腫瘤殺傷能力。

86、更進一步的，本發明還提供了一種藥物，其包括如下a)～e)中至少一項：

87、a)、tcr-t細胞、il4抗體和/或il4r抗體；

88、b)、如前所述的生物材料中至少一種；

89、c)、如前所述的tcr-t細胞中至少一種；

90、d)、如前所述制備方法制得的tcr-t細胞。

91、本發明所述的藥物至少包括兩種形式，其一，包括tcr-t或car-t等細胞和細胞因子的抗體，其中抗體用于封閉tcr-t或car-t等細胞表面的細胞因子受體，tcr-t或car-t等細胞可具有靶向性也可不具有，本發明對此不做限定。其二，使tcr-t或car-t等細胞內源表達細胞因子受體以實現封閉腫瘤微環境中細胞因子對tcr-t或car-t等細胞藥物的抑制作用。內源細胞因子受體的表達，可在同一細胞內，也可以在不同細胞內。當其在同一細胞內，外源片段可在同一載體也可在不同載體，本發明對此不做限定。

92、本發明所述的藥物中，還包括其他治療劑，所述其他治療劑選自其他用于治療腫瘤的藥物。所述其他用于治療腫瘤的藥物包括但不限于順鉑、紫杉醇、吉西他濱、貝伐珠單抗、阿帕替尼、安羅替尼、帕博利珠單抗、卡瑞利珠單抗、人參皂甙、靈芝提取物或冬蟲夏草。

93、本發明中，所述腫瘤是指惡性腫瘤，其包括實體瘤和非實體瘤。所述實體瘤包括：宮頸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、外陰癌、前列腺癌、腮腺癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、肺癌、纖維肉瘤、皮膚癌、鼻咽癌、舌癌、口腔癌、喉癌、腦瘤、膽囊癌、腎癌、牙齦癌、睪丸癌、陰莖癌、多發骨髓瘤和/或惡性黑色素瘤；所述非實體瘤包括：白血病和/或惡性淋巴瘤。

94、更進一步的，本發明提供了一種治療腫瘤的方法，其包括給予如前所述的藥物。

95、本發明中，所述給予的方式包括但不限于口服、噴霧吸入、直腸用藥、鼻腔用藥、頰部用藥、陰道用藥、局部用藥或非腸道用藥。所述非腸道用藥包括皮下、靜脈、肌內、腹膜內、鞘內、心室內、胸骨內和顱內注射或輸入、或借助一種外植儲器用藥。其中優選口服、腹膜內或靜脈內用藥方式。(如果是il4r/il7r增強型tcr-t細胞藥物則主要是靜脈回輸，如果聯合il4抗體或il4r抗體的tcr-t藥物，該抗體藥物的使用則可以是靜脈給藥，皮下給藥、口服用藥等形式)

96、本發明通過基因工程方法在tcr-t或car-t等細胞中引入il4r/il7r嵌合細胞因子受體，獲得可應用于治療il4陽性分泌的實體瘤的tcr-t或car-t等細胞。這種新型組合方式不僅可以解除il4和il4r結合介導的免疫抑制作用，而且可以扭轉該抑制信號為激活信號，促進tcr-t或car-t等細胞的進一步增殖和殺傷，獲得增強型的抗腫瘤活性tcr-t或car-t等細胞藥物，達到高效抗腫瘤的作用。

97、與單純的il4抗體或il4r抗體封閉技術相比，本發明是通過基因工程技術構建多基因協同表達的載體，可以將外源il4r/il7r和tcr分子同時引入t細胞。構建的增強型tcr-t細胞可以表達il4r，持續封閉腫瘤微環境中的il4，不僅是il4抗體或il4r抗體封閉的替代方法，而且因為il7r元件的存在，可以獲得比單純il4抗體或il4r抗體封閉更加持久的t細胞增殖殺傷能力。不僅減少了il4抗體或il4r抗體的持續使用，也意味著tcr-t等細胞制備工藝和時間上的縮短，節約了tcr-t或car-t等細胞反復治療的時間和經濟成本。