本公開涉及穩(wěn)定的信使核糖核酸(mrna)和編碼穩(wěn)定的mrna的dna的領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、聚腺苷酸化是在信使rna(mrna)的3’端添加多個腺嘌呤核苷酸，從而形成聚a尾的過程。所述聚a尾由多個重復(fù)腺嘌呤核苷酸(例如單磷酸腺苷)組成，而沒有其它堿基中斷序列。聚a尾對于mrna的核輸出、翻譯和穩(wěn)定性至關(guān)重要。在自然界中，當(dāng)mrna從dna產(chǎn)生時，末端轉(zhuǎn)移酶將腺嘌呤核苷酸添加到mrna的3’端。當(dāng)離體產(chǎn)生mrna時可應(yīng)用此酶促過程，但所述過程難以控制而且產(chǎn)生不同長度的聚a尾。通過在質(zhì)粒中編碼聚a尾，有可能降低聚a尾中的異質(zhì)性。然而，該過程不會消除異質(zhì)性，而且具有其它缺點，例如質(zhì)粒的潛在不穩(wěn)定性。

2、聚a尾充當(dāng)聚a結(jié)合蛋白的結(jié)合位點。聚a結(jié)合蛋白有助于從細(xì)胞核輸出mrna、翻譯并抑制mrna的降解。在沒有從細(xì)胞核輸出的情形下，mrna通常被外來體降解。聚a結(jié)合蛋白募集翻譯所需的蛋白質(zhì)。

3、mrna現(xiàn)在被用作治療分子，例如用于治療各種疾病和失調(diào)。mrna代替蛋白質(zhì)遞送給受試者，從而使得受試者的細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生由所述mrna編碼的蛋白質(zhì)。出于這些和其它目的，可通過從通常含于質(zhì)粒中的dna模板轉(zhuǎn)錄來制備mrna。在mrna生產(chǎn)期間，聚a尾可在從質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄后酶促地添加到mrna或在質(zhì)粒自身上編碼。當(dāng)在質(zhì)粒上編碼聚a尾時，聚a尾可能在質(zhì)粒dna復(fù)制的循環(huán)中變得更短(即，丟失腺嘌呤核苷酸)，這可能導(dǎo)致所得dna和后續(xù)mrna群體中巨大的變化。因此，本領(lǐng)域需要設(shè)計編碼聚a尾的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒在dna復(fù)制期間是穩(wěn)定的，并且抵抗編碼聚a腺嘌呤核苷酸的核苷酸的逐漸丟失。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本文公開了編碼聚腺苷酸化(聚a)尾的dna和包含聚腺苷酸化(聚a)尾的mrna，所述聚腺苷酸化(聚a)尾包含位于編碼目的蛋白質(zhì)的核苷酸3’的連續(xù)腺嘌呤核苷酸，其中通過插入非腺嘌呤核苷酸“錨”來穩(wěn)定所述聚a尾。

2、如本文所用，術(shù)語“聚a尾”是指mrna分子上的聚a尾，或dna質(zhì)粒內(nèi)編碼聚a尾的序列。聚a尾可由質(zhì)粒內(nèi)的互補(bǔ)dna序列編碼。dna序列中的重復(fù)胸腺嘧啶(t)核苷酸的序列(例如均聚物t序列)可編碼mrna上的聚a尾。兩個或更多個連續(xù)腺苷(例如腺苷或去氧腺苷)、胸苷或其它核苷酸稱為均聚物。天然聚a尾包含長的、不間斷的均聚物a序列。

3、本文所公開的非腺嘌呤核苷酸錨以規(guī)則或不規(guī)則隔開的間隔中斷聚a尾并穩(wěn)定編碼所述聚a尾的dna以及從所述dna產(chǎn)生的mrna。示例性非腺嘌呤核苷酸錨提供于表4中。例如，錨序列與聚a尾內(nèi)的兩個腺嘌呤核苷酸均聚物序列毗鄰。

4、在一些實施例中，涵蓋dna組合物，其包含編碼位于編碼目的蛋白質(zhì)的核苷酸3’的聚腺苷酸化(聚a)尾的核苷酸，其中所述聚a尾包含至少8個連續(xù)腺嘌呤(a)核苷酸和一個或多個非腺嘌呤(a)核苷酸。

5、在一些實施例中，聚a尾包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90個連續(xù)腺嘌呤核苷酸。

6、在一些情況中，與包含僅含有腺嘌呤核苷酸的相似或相同長度的3’尾的dna中所發(fā)生的丟失相比，所述一個或多個非腺嘌呤核苷酸防止dna復(fù)制期間一個或多個腺嘌呤核苷酸的丟失。

7、在一些實施例中，所述一個或多個非腺嘌呤核苷酸經(jīng)定位以中斷連續(xù)腺嘌呤核苷酸，使得聚(a)結(jié)合蛋白可結(jié)合到連續(xù)腺嘌呤核苷酸的區(qū)段。

8、在一些實施例中，聚a尾包含至少總共50個腺嘌呤核苷酸。

9、在一些實施例中，聚a尾包含總共40-500個腺嘌呤核苷酸。

10、在一些情況中，聚a尾包含總共95-100個腺嘌呤核苷酸。

11、在一些實施例中，聚a尾包含或含有總共90、91、92、93、94、95、96或97個腺嘌呤核苷酸。

12、在一些實施例中，聚a尾包含或含有總共96或97個腺嘌呤核苷酸。

13、在一些實施例中，聚a尾包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或一個2-10個非腺嘌呤核苷酸連續(xù)區(qū)段。

14、在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11或12個連續(xù)腺嘌呤核苷酸之后。

15、在一些情況中，所述一個或多個非腺嘌呤核苷酸位于至少8-50個連續(xù)腺嘌呤核苷酸之后。

16、在一些實施例中，所述一個或多個非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個連續(xù)腺嘌呤核苷酸之后。

17、在一些實施例中，聚a尾每8-50個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或一個2-10個核苷酸連續(xù)區(qū)段。在一些實施例中，聚a尾每8-50個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或一個包含至少兩個非腺嘌呤核苷酸的2-10個核苷酸連續(xù)區(qū)段。在一些實施例中，聚a尾具有一個或多個非腺嘌呤核苷酸或一個或多個2-10個非腺嘌呤核苷酸連續(xù)區(qū)段，其沿聚a尾的長度在任意地方不規(guī)則地隔開，其中沿聚a尾長度的某處存在至少8個連續(xù)腺嘌呤。例如，聚a尾的長度可以是70-1000個核苷酸，且具有任何數(shù)量的沿長度不規(guī)則隔開的非腺嘌呤(單個或成組)，只要存在一個或多個至少8個連續(xù)腺嘌呤的區(qū)段即可。

18、在一些情況中，聚a尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或一個2-10個核苷酸連續(xù)區(qū)段。

19、在一些情況中，聚a尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或一個包含至少兩個非腺嘌呤核苷酸的2-10個核苷酸連續(xù)區(qū)段。

20、在一些實施例中，聚a尾每8-50個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5個連續(xù)非腺嘌呤核苷酸。

21、在一些情況中，聚a尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5個連續(xù)非腺嘌呤核苷酸。

22、在一些實施例中，聚a尾包含或含有一個以上非腺嘌呤核苷酸或一個以上2-10個核苷酸連續(xù)區(qū)段作為聚a尾內(nèi)不規(guī)則隔開的中斷序列。

23、在一些實施例中，聚a尾包含或含有在聚a尾內(nèi)不規(guī)則隔開的一個以上非腺嘌呤核苷酸或一個以上包含至少兩個非腺嘌呤核苷酸的2-10個核苷酸連續(xù)區(qū)段。

24、在一些情況中，聚a尾每12個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5個連續(xù)非腺嘌呤核苷酸。

25、在一些實施例中，聚a尾每16個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5個連續(xù)非腺嘌呤核苷酸。

26、在一些實施例中，聚a尾每25個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5個連續(xù)非腺嘌呤核苷酸。

27、在一些情況中，聚a尾每30個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5個連續(xù)非腺嘌呤核苷酸。

28、在一些實施例中，聚a尾每39個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5個連續(xù)非腺嘌呤核苷酸。

29、在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸是鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些情況中，非腺嘌呤核苷酸是鳥嘌呤核苷酸。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸是胞嘧啶核苷酸。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸是胸腺嘧啶核苷酸。

30、在存在一個以上非腺嘌呤核苷酸的一些情況中，非腺嘌呤核苷酸可選自：a)鳥嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸；b)鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸；c)胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸；或d)鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸。

31、在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸由一個選自鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的非腺嘌呤核苷酸組成。

32、在一些情況中，非腺嘌呤核苷酸包含兩個選自鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的一種或多種的非腺嘌呤核苷酸。

33、在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸包含三個選自鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的一種或多種的非腺嘌呤核苷酸。

34、腺嘌呤核苷酸可為單磷酸腺苷。

35、在一些實施方例中，由mrna編碼的蛋白質(zhì)是治療性蛋白質(zhì)。在一些情況中，所述蛋白質(zhì)是細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、cas9或經(jīng)修飾的cas9。

36、在一些實施例中，涵蓋由本文所述的任意dna編碼的mrna。

37、在一些實施例中，dna在載體內(nèi)。載體可在宿主細(xì)胞內(nèi)，包括昆蟲、細(xì)菌或哺乳動物(例如人類)細(xì)胞。

38、在一些實施例中，與包含編碼僅含有腺嘌呤核苷酸的相似或相同長度的聚a尾的核苷酸的dna中所發(fā)生的丟失相比，所述一個或多個非腺嘌呤核苷酸防止宿主細(xì)胞生長期間載體內(nèi)編碼聚a尾的核苷酸的丟失。

39、涵蓋從本文所述的任意dna載體產(chǎn)生mrna的方法，其包括：使聚a尾下游的載體線性化；使所述線性化載體變性；以及在鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和腺嘌呤核苷酸存在下使變性dna與rna聚合酶接觸。

40、在一些實施例中，本公開包括dna，其包含編碼位于編碼目的蛋白質(zhì)的核苷酸3’的聚腺苷酸化(聚a)尾的核苷酸，其中所述聚a尾包含至少8個連續(xù)腺嘌呤(a)核苷酸的第一均聚物序列和包含一個或多個非腺嘌呤(a)核苷酸的中斷序列。在一些這樣的實施例中，聚a尾進(jìn)一步包含至少連續(xù)腺嘌呤(a)核苷酸的第二均聚物序列。在一些實施例中，聚a尾包含至少8個連續(xù)腺嘌呤(a)核苷酸的三個或更多個均聚物序列。在一些實施例中，第一和/或后續(xù)均聚物序列包含至少10、15、20、25、30、35或40個連續(xù)腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，與包含僅含有腺嘌呤核苷酸的相似或相同長度的3’尾的dna中所發(fā)生的丟失相比，所述一個或多個非腺嘌呤核苷酸防止dna復(fù)制期間一個或多個腺嘌呤核苷酸的丟失。在一些實施例中，所述一個或多個非腺嘌呤核苷酸經(jīng)定位以中斷連續(xù)腺嘌呤核苷酸，使得聚(a)結(jié)合蛋白可結(jié)合到連續(xù)腺嘌呤核苷酸的區(qū)段。在一些實施例中，聚a尾包含至少總共50個腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，聚a尾包含總共40-1000、40-900、40-800、40-700、40-600、40-500、40-400、40-300、40-200或40-100個腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，聚a尾包含總共95-100個腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，聚a尾包含或含有總共90、91、92、93、94、95、96或97個腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，聚a尾包含或含有總共96或97個腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，所述一個或多個中斷序列包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或一個2-10個非腺嘌呤核苷酸連續(xù)區(qū)段。在一些實施例中，所述一個或多個中斷序列包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或一個包括兩個或更多個非腺嘌呤核苷酸的2-10個核苷酸連續(xù)區(qū)段。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11或12個連續(xù)腺嘌呤核苷酸之后。在一些實施例中，所述一個或多個非腺嘌呤核苷酸位于至少8-50個連續(xù)腺嘌呤核苷酸之后。在一些實施例中，所述一個或多個非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個連續(xù)腺嘌呤核苷酸之后。

41、在一些實施例中，如前一段所述，中斷序列是三核苷酸、二核苷酸或單核苷酸中斷序列。在一些這樣的實施例中，聚a尾每8-50個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或一個2-10個非腺嘌呤核苷酸連續(xù)區(qū)段。在一些實施例中，聚a尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或一個2-10個非腺嘌呤核苷酸連續(xù)區(qū)段。在一些實施例中，聚a尾每8-50個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5個連續(xù)非腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，聚a尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5個連續(xù)非腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，聚a尾包含或含有一個以上非腺嘌呤核苷酸或一個以上2-10個非腺嘌呤核苷酸連續(xù)區(qū)段。在一些實施例中，所述一個以上非腺嘌呤核苷酸或一個以上2-10個非腺嘌呤核苷酸連續(xù)區(qū)段在聚a尾內(nèi)不規(guī)則地隔開。在一些實施例中，聚a尾每12個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5個連續(xù)非腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，聚a尾每16個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5個連續(xù)非腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，聚a尾每25個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5個連續(xù)非腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，聚a尾每30個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5個連續(xù)非腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，聚a尾每39個連續(xù)腺嘌呤核苷酸包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5個連續(xù)非腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸是鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸是鳥嘌呤核苷酸。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸是胞嘧啶核苷酸。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸是胸腺嘧啶核苷酸。在一些實施例中，dna包含一個以上選自以下的非腺嘌呤核苷酸：(a)鳥嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸；(b)鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸；(c)胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸；或(d)鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸。在上文所述的一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸由一個選自鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的非腺嘌呤核苷酸組成。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸包含兩個選自鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一種或多種的非腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸包含三個選自鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一種或多種的非腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，腺嘌呤核苷酸是單磷酸腺苷。在一些實施例中，蛋白質(zhì)是治療性蛋白質(zhì)。在一些實施例中，蛋白質(zhì)是細(xì)胞因子或趨化因子。在一些實施例中，蛋白質(zhì)是生長因子。在一些實施例中，蛋白質(zhì)是cas9或經(jīng)修飾的cas9。

42、本公開還涵蓋由如先前段落中所述dna編碼的mrna。

43、在一些實施例中，先前段落中所述的dna也可包含在載體內(nèi)。在一些實施例中，載體包含在宿主細(xì)胞內(nèi)。在dna是在載體內(nèi)的一些實施例中，與包含編碼僅含有腺嘌呤核苷酸的相似或相同長度的聚a尾的核苷酸的dna中所發(fā)生的丟失相比，所述一個或多個非腺嘌呤核苷酸防止宿主細(xì)胞生長期間載體內(nèi)編碼聚a尾的核苷酸的丟失。

44、本公開還涵蓋從本文所述dna載體產(chǎn)生mrna的方法，其包括：(a)使聚a尾下游的載體線性化；(b)使所述線性化載體變性；以及(c)在鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和腺嘌呤核苷酸存在下使變性dna與rna聚合酶接觸。