本發(fā)明屬于植物基因工程，尤其涉及一種基于rna病毒誘導的葉菜類蔬菜沉默體系及其構(gòu)建方法和應用。

背景技術(shù)：

1、病毒誘導的基因沉默技術(shù)(virus-induced?gene?silencing，vigs)是一種快速驗證植物基因功能的方法。vigs能夠特異性結(jié)合并降解轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mrna，引起目的基因沉默，對沉默個體進行分析即可確定基因的功能。vigs一般在整個植株水平引起基因沉默，該方法無需進行植物穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，且不改變基因組dna序列，但可以產(chǎn)生與突變體相似的表型特征，是一種快速有效解析基因功能的方法。

2、上海青(brassica?rapa?subsp.chinensis)又稱小白菜，隸屬于十字花科蕓薹屬，富含抗壞血酸，硫代葡萄糖苷、蘿卜硫素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價值。芥菜(brassicajuncea(l.)czern.)隸屬于十字花科蕓薹屬，富含維生素，且具有利肺豁痰，消腫散結(jié)等功效。目前并沒有關于以上海青和芥菜為研究對象，通過vigs系統(tǒng)對其內(nèi)源pds基因進行沉默的報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于rna病毒誘導的葉菜類蔬菜vigs沉默體系，將沉默體系導入上海青和芥菜葉片，應用vigs技術(shù)沉默了內(nèi)源pds基因。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

3、一種基于rna病毒誘導的葉菜類蔬菜vigs沉默體系，包括載體ptrv1和含有目的基因片段的重組載體ptrv2，所述目的基因片段包括brpds、bjupds-g和bjupds-c中的任意一種。

4、優(yōu)選的，所述目的基因片段brpds的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述目的基因片段bjupds-g的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述目的基因片段bjupds-c的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

5、優(yōu)選的，brpds片段的克隆方法包括：提取上海青總rna，反轉(zhuǎn)錄得到cdna第一鏈，以此鏈為模板，以seq?id?no.10和seq?id?no.11所示的核苷酸序列為引物，擴增獲得帶有同源臂的brpds片段；bjupds-g片段的克隆方法包括：提取抱子芥總rna，反轉(zhuǎn)錄得到cdna第一鏈，以此鏈為模板，以seq?id?no.12和seq?id?no.13所示的核苷酸序列為引物，擴增獲得帶有同源臂的bjupds-g片段；bjupds-c片段的克隆方法包括：提取結(jié)球芥總rna，反轉(zhuǎn)錄得到cdna第一鏈，以此鏈為模板，以seq?id?no.14和seq?id?no.15所示的核苷酸序列為引物，擴增獲得帶有同源臂的bjupds-c片段。

6、本發(fā)明的另一目的在于提供所述的葉菜類蔬菜vigs沉默體系在沉默葉類蔬菜pds基因中的應用，將含有目的基因片段的重組載體ptrv2轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞制備重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒和載體ptrv1分別轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌gv3101感受態(tài)細胞，獲得含載體ptrv1的菌液和含重組載體ptrv2的菌液，將含載體ptrv1的菌液和含重組載體ptrv2的菌液混合獲得侵染液，將侵染液注射到葉菜類蔬菜葉片。

7、優(yōu)選的，所述葉類蔬菜為上海青、抱子芥和結(jié)球芥。

8、優(yōu)選的，所述侵染液含有連接brpds片段的重組載體ptrv2時，注射到上海青葉片；所述侵染液含有連接bjupds-g片段的重組載體ptrv2時，注射到抱子芥葉片；所述侵染液含有連接bjupds-c片段的重組載體ptrv2時，注射到結(jié)球芥葉片。

9、優(yōu)選的，注射到上海青葉片時，所述侵染液od600＝0.3～1.0；注射到抱子芥葉片時，所述侵染液od600＝0.5～0.8；注射到結(jié)球芥葉片時，所述侵染液od600＝0.5～1.0。

10、優(yōu)選的，含載體ptrv1的菌液和含重組載體ptrv2的菌液按體積比1:1混合。

11、優(yōu)選的，所述葉菜類蔬菜為6片真葉期。

12、本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測葉類蔬菜pds基因的試劑盒，所述試劑盒包括：檢測上海青brpds基因的引物組，所述引物組的核苷酸序列如seq?id?no.20和seq?idno.21所示；檢測抱子芥bjupds-g基因的引物組，所述引物組的核苷酸序列如seq?id?no.24和seq?id?no.25所示；檢測結(jié)球芥bjupds-c基因的引物組，所述引物組的核苷酸序列如seqidno.26和seq?id?no.27所示。

13、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

14、本發(fā)明提供了一種基于rna病毒誘導的葉菜類蔬菜vigs沉默體系，通過構(gòu)建ptrv2-brpds、ptrv2-bjupds-g和ptrv2-brpds-c沉默表達載體，將沉默表達載體導入上海青和芥菜葉片，成功地應用vigs技術(shù)沉默了內(nèi)源pds基因，導致上海青和芥菜植株產(chǎn)生不同程度的白化表型，為研究上海青和芥菜基因功能提供了技術(shù)支持，有助于加快上海青和芥菜功能基因研究的速度。

技術(shù)特征：

1.一種基于rna病毒誘導的葉菜類蔬菜vigs沉默體系，其特征在于，包括載體ptrv1和含有目的基因片段的重組載體ptrv2，所述目的基因片段包括brpds、bjupds-g和bjupds-c中的任意一種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉菜類蔬菜vigs沉默體系，其特征在于，所述目的基因片段brpds的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述目的基因片段bjupds-g的核苷酸序列如seqid?no.2所示，所述目的基因片段bjupds-c的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉菜類蔬菜vigs沉默體系，其特征在于，brpds片段的克隆方法包括：提取上海青總rna，反轉(zhuǎn)錄得到cdna第一鏈，以此鏈為模板，以seq?id?no.10和seqid?no.11所示的核苷酸序列為引物，擴增獲得帶有同源臂的brpds片段；

4.權(quán)利要求1～3任意一項所述的葉菜類蔬菜vigs沉默體系在沉默葉類蔬菜pds基因中的應用，其特征在于，將含有目的基因片段的重組載體ptrv2轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞制備重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒和載體ptrv1分別轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌gv3101感受態(tài)細胞，獲得含載體ptrv1的菌液和含重組載體ptrv2的菌液，將含載體ptrv1的菌液和含重組載體ptrv2的菌液混合獲得侵染液，將侵染液注射到葉菜類蔬菜葉片。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，所述葉類蔬菜為上海青、抱子芥和結(jié)球芥。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，所述侵染液含有連接brpds片段的重組載體ptrv2時，注射到上海青葉片；所述侵染液含有連接bjupds-g片段的重組載體ptrv2時，注射到抱子芥葉片；所述侵染液含有連接bjupds-c片段的重組載體ptrv2時，注射到結(jié)球芥葉片。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，注射到上海青葉片時，所述侵染液od600＝0.3～1.0；注射到抱子芥葉片時，所述侵染液od600＝0.5～0.8；注射到結(jié)球芥葉片時，所述侵染液od600＝0.5～1.0。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，含載體ptrv1的菌液和含重組載體ptrv2的菌液按體積比1:1混合。

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，所述葉菜類蔬菜為6片真葉期。

10.一種檢測葉類蔬菜pds基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種基于RNA病毒誘導的葉菜類蔬菜沉默體系及其構(gòu)建方法和應用，屬于植物基因工程技術(shù)領域。本發(fā)明通過構(gòu)建pTRV2?BrPDS、pTRV2?BjuPDS?g和pTRV2?BrPDS?c沉默表達載體，將沉默表達載體導入上海青和芥菜葉片，成功地應用VIGS技術(shù)沉默了內(nèi)源PDS基因，導致上海青和芥菜植株產(chǎn)生不同程度的白化表型，為研究上海青和芥菜基因功能提供了技術(shù)支持，有助于加快上海青和芥菜功能基因研究的速度。

技術(shù)研發(fā)人員：馬燕勤,楊亮,龍海城,周玉潔,李菊,常偉,李志,苗明軍,鐘建
受保護的技術(shù)使用者：四川省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/24