本發明涉及特發性肺纖維化，具體涉及一種負載sifkbp10的靶向外泌體及其制備方法與應用。

背景技術：

1、公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

2、特發性肺纖維化(ipf)是一種進行性限制性肺疾病，其特征是復雜的機制、信號通路和細胞相互作用。ipf急性加重后的中位生存期大約為3-5年，具有高發病率和死亡率，特別是在歐洲和北美。ipf通常與異常的上皮細胞激活、反復損傷和修復受損有關。異常上皮細胞與免疫細胞之間的相互作用導致肌成纖維細胞的激活，進而導致轉化生長因子-β(tgf-β)的過度分泌，這導致細胞外基質(ecm)如i型膠原(col-1)的過度沉積，阻礙了肺泡之間的氣體交換。在ipf的發展中，肌成纖維細胞是主要的效應細胞，它們主要從激活的肺成纖維細胞分化而來，并分泌平滑肌肌動蛋白(α-sma)。fk506結合蛋白(fkbp10)最初在小鼠成纖維細胞中被發現，定位于粗面內質網，并參與前膠原的生物合成。fkbp10表現出肽酰脯氨酸順反異構酶活性，這是在將線性膠原鏈組裝成膠原三螺旋過程中，脯氨酸轉變為反式脯氨酸所必需的。fkbp10直接與細胞內的膠原相互作用。fkbp10的表達在出生后的骨骼和韌帶中受到發育調控，并在受損組織中重新激活。fkbp10的突變可能導致隱性成骨不全和bruck綜合征。下調fkbp10的表達可以減少肺成纖維細胞中膠原和纖維連接蛋白(fn)的產生，抑制肌成纖維細胞的遷移。然而，由于對fkbp10三維結構的了解不足，導致目前尚無針對fkbp10的有效抑制劑。

技術實現思路

1、針對上述的問題，本發明提供一種負載fkbp10的小干擾rna(sifkbp10)靶向外泌體及其制備方法與應用，其能夠顯著降低細胞中fkbp10的表達，抑制了細胞外基質(ecm)的過度沉積，對特發性肺纖維化具有良好的抑制效果，為ipf的治療提供了新的治療策略。具體地，本發明的技術方案如下所示。

2、首先，本發明公開一種負載sifkbp10的靶向外泌體(rdyh58-sifkbp10)，其包括具有膜蛋白lamp2b的細胞外泌體以及與該膜蛋白結合的靶向肌成纖維細胞的rdyh58肽，且所述細胞外泌體裝載sifkbp10。所述rdyh58肽的cdna序列如seq.id.no.1所示：agggactaccaccccagggaccacaccgccacctggggcggctgc。所述sifkbp10的正義鏈如seq.id.no.2所示：agcucaagcugaagucaga，反義鏈如seq.id.no.3所示：ucugacuucagcuugagcu。

3、其次，本發明公開一種負載sifkbp10的靶向外泌體的制備方法，包括如下步驟：

4、(1)通過同源重組得到重組質粒gnstm-rdyh58-lamp2b-ha。

5、(2)將所述重組質粒gnstm-rdyh58-lamp2b-ha轉染到轉染細胞中，然后進行培養，完成后分離出外泌體，即得外泌體rdyh58-exo，其能夠表達rdyh58-lamp2b-ha。

6、(3)采用超聲微流控法將sifkbp10裝載到所述外泌體rdyh58-exo中，即得負載sifkbp10的靶向外泌體(rdyh58-sifkbp10)。

7、進一步地，步驟(1)中，將質粒載體gnstm-rvg-lamp2b-ha中的rvg肽替換為肌成纖維細胞的rdyh58肽，得到所述重組質粒gnstm-rdyh58-lamp2b-ha。

8、進一步地，步驟(1)中，在所述質粒載體(gnstm-rvg-lamp2b-ha)上的rvg肽序列的兩端設計引物：正向引物：5‘-taactcgactatgggcagtgga-’3，反向引物：5‘-ggcagtggatctggatccggtg-’3，以便于進行環狀質粒擴增。然后進行同源重組得到所述重組質粒gnstm-rdyh58-lamp2b-ha。

9、進一步地，步驟(1)中，將所述重組質粒轉化到大腸桿菌中進行培養，完成后提取出質粒，即得所述的重組質粒。可選地，所述培養的溫度為37～38℃，培養時間為16～24h。

10、進一步地，步驟(2)中，所述轉染細胞包括hek293f、任意的懸浮或貼壁細胞。

11、進一步地，步驟(2)中，將轉染試劑與所述重組質粒gnstm-rdyh58-lamp2b-ha混合，孵育后加入到培養基中進行所述的培養。可選地，轉染試劑與重組質粒的孵育時間為15min，所述細胞培養時間為48～72小時，培養溫度為37～38℃。

12、進一步地，所述轉染試劑與重組質粒gnstm-rdyh58-lamp2b-ha的比例為1ml：500μg。可選地，所述轉染試劑包括lipo293ftm轉染試劑或其他任意適合的轉染試劑。

13、進一步地，步驟(2)中，所述分離出外泌體的步驟包括：對得到的培養液進行離心去除細胞和細胞碎片，將得到的上清液過濾后進行超速離心處理，從而獲得外泌體rdyh58-exo。

14、進一步地，步驟(3)中，所述超聲微流控法包括步驟：將所述外泌體rdyh58-exo與sifkbp10加到緩沖液中，然后將得到的混合液加到自動注射泵中，然后在超聲條件下進行注射。可選地，所述外泌體rdyh58-exo與sifkbp10的質量比例為1：5～1：1。所述超聲的功率為10～100w。

15、最后，本發明公開所述負載sifkbp10的靶向外泌體在制備特發性肺纖維化的治療藥物中的應用。

16、相較于現有技術，本發明的技術方案至少具有以下方面的有益效果：本發明的負載sifkbp10的靶向外泌體rdyh58-sifkbp10更傾向于和肌成纖維細胞共定位而不是與上皮細胞或內皮細胞，這意味著rdyh58-sifkbp10對肌成纖維細胞具有良好的靶向性。從而對肌成纖維細胞中fkbp10的表達進行抑制，抑制肌成纖維細胞的激活，進而抑制ecm的過度沉積和抑制肌成纖維細胞的遷移和分化，抑制細胞的纖維化發展，是治療特發性肺纖維化的有效手段。其原因在于肌成纖維細胞是肺纖維化的發展中的主要效應細胞，而fkbp10是主要存在于肌成纖維細胞的治療靶點。fkbp10具有肽基脯氨酰順式/反式異構酶活性，在線性膠原鏈組裝成膠原三螺旋的過程中，需要脯氨酸與反式脯氨酸的異構化，fkbp10的缺失阻礙纖維化的過度發生。

技術特征：

1.一種負載sifkbp10的靶向外泌體，其特征在于，包括具有膜蛋白lamp2b的細胞外泌體以及與該膜蛋白結合的肌成纖維細胞的rdyh58肽，且所述細胞外泌體通過所述sifkbp10修飾；所述rdyh58肽的cdna序列如seq.id.no.1所示；所述sifkbp10的正義鏈如seq.id.no.2所示，反義鏈如seq.id.no.3所示。

2.一種負載sifkbp10的靶向外泌體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

3.根據權利要求2所述的負載sifkbp10的靶向外泌體的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，將質粒載體gnstm-rvg-lamp2b-ha中的rvg肽替換為肌成纖維細胞的rdyh58肽，得到所述重組質粒gnstm-rdyh58-lamp2b-ha；

4.根據權利要求2所述的負載sifkbp10的靶向外泌體的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，將所述重組質粒轉化到大腸桿菌中進行培養，完成后提取出質粒，即得所述的重組質粒；可選地，所述培養的溫度為37～38℃，培養時間為16～24h。

5.根據權利要求2所述的負載sifkbp10的靶向外泌體的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述轉染細胞包括hek293f、任意的懸浮或貼壁細胞。

6.根據權利要求2所述的負載sifkbp10的靶向外泌體的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，將轉染試劑與所述重組質粒gnstm-rdyh58-lamp2b-ha混合，孵育后加入到培養基中進行所述的培養；可選地，所述培養時間為48～72小時，培養溫度為37～38℃。

7.根據權利要求6所述的負載sifkbp10的靶向外泌體的制備方法，其特征在于，所述轉染試劑與重組質粒gnstm-rdyh58-lamp2b-ha的比例為1ml：500μg；可選地，所述轉染試劑包括lipo293ftm轉染試劑。

8.根據權利要求2所述的負載sifkbp10的靶向外泌體的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述分離出外泌體的步驟包括：對得到的培養液進行離心去除細胞和細胞碎片，將得到的上清液過濾后進行超速離心處理，即得所述外泌體rdyh58-exo。

9.根據權利要求2-8任一項所述的負載sifkbp10的靶向外泌體的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述超聲微流控法包括步驟：將所述外泌體rdyh58-exo與sifkbp10加到緩沖液中，然后將得到的混合液加到自動注射泵中，然后在超聲條件下進行注射；可選地，所述外泌體rdyh58-exo與sifkbp10的質量比例為1：5～1：1。

10.權利要求1所述負載sifkbp10的靶向外泌體，或者權利要求2-9任一項所述制備方法得到的靶向外泌體在制備特發性肺纖維化的治療藥物中的應用。

技術總結
本發明公開一種負載siFKBP10的靶向外泌體及其制備方法與應用。所述靶向外泌體包括具有膜蛋白Lamp2b的細胞外泌體以及與該膜蛋白結合的肌成纖維細胞的RDYH58肽，且所述細胞外泌體通過所述siFKBP10修飾；所述RDYH58肽的cDNA序列如SEQ.ID.NO.1所示；所述siFKBP10的正義鏈如SEQ.ID.NO.2所示，反義鏈如SEQ.ID.NO.3所示。本發明的所述靶向外泌體能夠顯著降低細胞中FKBP10的表達，抑制了細胞外基質的過度沉積，對特發性肺纖維化具有良好的抑制效果，為IPF的治療提供了新的治療策略。

技術研發人員：史亞楠,袁然然,張厚乾,慕震,楚永超,崔欣雨,王洪波,鄭巍
受保護的技術使用者：煙臺大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24