本發明屬于基因檢測，具體涉及一種高分辨率dna拓撲異構分析方法。

背景技術：

1、dna的超螺旋拓撲結構檢測廣泛應用在遺傳疾病診斷、dna圖譜分析、pcr產物分析、基因拷貝數變化檢測、突變檢測、連鎖分析、基因遺傳多樣性分析、基因重排和結構變異檢測、病毒dna檢測、基因組特定區域的特性分析等領域。dna拓撲異構分析主要包括制膠；電泳；轉膜(即將待測定核酸分子通過一定的方法轉移并結合到一定的固相支持物(硝酸纖維素膜或尼龍膜)上，即印跡)；分子雜交(即將上一步固定于膜上的核酸與同位素標記的探針在一定的溫度和離子強度下雜交)；顯影等過程。每一步都需要精細化處理，任何一步操作出現問題，都會導致結果不理想，不能獲得高分辨率的結果圖，如出現很多非特異性條帶，條帶分辨率較低，條帶變形，條帶模糊，出現雜質，背景太暗、太淺等，這些均會導致最終的圖像質量較差。因此獲得清晰可見的條帶對dna圖譜分析，檢測樣品中的dna及其含量，pcr產物分析等領域的發展具有重要意義。

技術實現思路

1、本發明的目的在于提供一種高分辨率dna拓撲異構分析方法。本發明所述方法能夠實現高分辨率的dna拓撲異構分析。

2、本發明提供了一種高分辨率dna拓撲異構分析方法，包括以下步驟：

3、提取dna，檢測dna濃度；

4、制備瓊脂糖凝膠；

5、以相同的總量將dna上樣到瓊脂糖凝膠膠孔中；

6、設置電壓強度、電泳時間和環境溫度后，進行瓊脂糖凝膠電泳；

7、電泳后，切膠，進行轉膜；所述轉膜在轉印裝置中加注轉印緩沖液，平行轉印槽短邊且過轉印槽中心放一塊搭橋的下玻璃板，在下玻璃板上放置第一濾紙來搭橋，得到厚濾紙橋；在厚濾紙橋上平鋪與膠塊大小相同的的第二濾紙；將切好的膠塊置于第二濾紙上，鋪平；將與膠塊大小相同的尼龍膜置于膠塊上方，鋪平；將與膠塊大小相同的第三濾紙置于尼龍膜上方，鋪平；將尺寸大于等于膠塊大小的吸水紙置于第三濾紙上方，鋪平；將上玻璃板置于吸水紙上方，再放置砝碼；

8、轉膜后，取出尼龍膜進行放射雜交，掃描成像，分析并解讀dna拓撲異構信息。

9、優選的是，dna濃度使用nanodrop儀器和qubit4儀器進行雙檢測。

10、優選的是，所述電壓強度為50v；所述電泳時間為48h；所述環境溫度為4℃。

11、優選的是，所述切膠的位置包括：從距離觀察到的基因組dna條帶下方1.5cm處進行切膠，直至切出10cm的長度。

12、優選的是，吸水紙的每個邊長比膠塊每個邊長長0.5～1cm；吸水紙的數量為70～80張。

13、優選的是，所述下玻璃板和上玻璃板的厚度為8mm。

14、優選的是，所述第一濾紙的厚度為0.53mm；所述第二濾紙和第三濾紙的厚度均為0.2mm。

15、優選的是，所述第一濾紙、第二濾紙、膠塊、尼龍膜、第三濾紙、吸水紙、上玻璃板和砝碼的垂心在同一垂線上。

16、優選的是，所述第一濾紙、第二濾紙、膠塊、尼龍膜、第三濾紙、吸水紙、上玻璃板和砝碼之間均無氣泡，且均平整。

17、優選的是，所述轉印緩沖液為氫氧化鈉緩沖液；所述轉印緩沖液的添加量為轉印裝置容積2/3。

18、本發明提供了一種高分辨率dna拓撲異構分析方法。本發明所述方法能夠實現高分辨率的dna拓撲異構分析。對遺傳病分析，基因治療，dna疫苗研究，dna圖譜分析，檢測樣品中的dna及其含量，pcr產物分析等領域的發展具有重要意義。試驗結果表明，本發明方法得到的條帶非常清晰，條帶分離效果極好，條帶之間沒有相互重疊覆蓋發生，條帶筆直，沒有傾斜，也沒有彎曲的條帶，而且背景較淡，不需要增大曝光來顯示條帶，可以非常好的判讀每一個條帶的細節信息。

技術特征：

1.一種高分辨率dna拓撲異構分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據權利要求1所述的高分辨率dna拓撲異構分析方法，其特征在于，dna濃度使用nanodrop儀器和qubit4儀器進行雙檢測。

3.根據權利要求1所述的高分辨率dna拓撲異構分析方法，其特征在于，所述電壓強度為50v；所述電泳時間為48h；所述環境溫度為4℃。

4.根據權利要求1所述的高分辨率dna拓撲異構分析方法，其特征在于，所述切膠的位置包括：從距離觀察到的基因組dna條帶下方1.5cm處進行切膠，直至切出10cm的長度。

5.根據權利要求1所述的高分辨率dna拓撲異構分析方法，其特征在于，吸水紙的每個邊長比膠塊每個邊長長0.5～1cm；吸水紙的數量為70～80張。

6.根據權利要求1所述的高分辨率dna拓撲異構分析方法，其特征在于，所述下玻璃板和上玻璃板的厚度為8mm。

7.根據權利要求1所述的高分辨率dna拓撲異構分析方法，其特征在于，所述第一濾紙的厚度為0.53mm；所述第二濾紙和第三濾紙濾紙的厚度均為0.2mm。

8.根據權利要求1所述的高分辨率dna拓撲異構分析方法，其特征在于，所述第一濾紙、第二濾紙、膠塊、尼龍膜、第三濾紙、吸水紙、上玻璃板和砝碼的垂心在同一垂線上。

9.根據權利要求1所述的高分辨率dna拓撲異構分析方法，其特征在于，所述第一濾紙、第二濾紙、膠塊、尼龍膜、第三濾紙、吸水紙、上玻璃板和砝碼之間均無氣泡，且均平整。

10.根據權利要求1所述的高分辨率dna拓撲異構分析方法，其特征在于，所述轉印緩沖液為氫氧化鈉緩沖液；所述轉印緩沖液的添加量為轉印裝置容積的2/3。

技術總結
本發明提供了一種高分辨率DNA拓撲異構分析方法，具體屬于基因檢測技術領域。本發明所述高分辨率DNA拓撲異構分析方法包括以下步驟：提取DNA，檢測DNA濃度；制備瓊脂糖凝膠；以相同的總量將DNA上樣到瓊脂糖凝膠膠孔中；設置電壓強度、電泳時間和環境溫度后，進行瓊脂糖凝膠電泳；電泳后，切膠，進行轉膜；轉膜后，取出尼龍膜進行放射雜交，掃描成像，分析并解讀DNA拓撲異構信息。本發明所述方法能夠實現高分辨率的DNA拓撲結構分析，可廣泛應用與細胞生物學、分子生物學、病理學、免疫學和內分泌學等領域，對遺傳疾病診斷、基因治療、DNA圖譜分析、檢測樣品中的DNA及其含量、PCR產物分析等領域的發展具有重要意義。

技術研發人員：張霞,霍金龍,霍海龍
受保護的技術使用者：呂梁學院
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24