本發明涉及一種新型蛋白孔及其用途。特別地，其涉及在核酸測序應用及分子感測中的生物納米孔。本發明涉及csgg的突變形式。本發明還涉及采用csgg的分析物檢測和表征。

背景技術：

1、蛋白孔是形成膜中通道的跨膜多肽和復合物，離子和某些分子可以通過該通道。所述通道的最小直徑典型的處在納米范圍內(10-9米)，因此將這些多肽中的某些命名為“納米孔”。

2、納米孔具有作為生物傳感器的巨大潛力。當結合在膜上的納米孔被施加電勢時，離子從所述通道中流過。該離子流可以作為電流被測量。例如，wo2000/28312和d.stoddartet?al.,proc.natl.acad.sci.,2010,106,7702-7中描述了使用單通道記錄設備的合適的電學檢測技術。例如，wo2009/077734中描述了多通道記錄技術。

3、通過所述孔，或結合到所述孔中或接近所述孔的分子轉錄用于阻礙并從而降低通過所述通道的離子流。離子流的降低程度指示孔內或其附近的阻塞的尺寸，該離子流降低程度通過電流的下降進行測量。因此被測量的電流可以用于測量通道阻塞的大小或程度。電流的變化可以用于識別分子或分子的一部分已經在所述孔(分子傳感)或接近所述孔或在特定體系中結合，其可以用于基于分子大小測定位于孔內分子的身份(核酸測序)。

4、“鏈測序”方法是已知的采用生物納米孔對核酸進行測序的方法。將單鏈多核苷酸通過納米孔，當它們瞬時穿過納米孔通道時，每個核苷酸上的堿基通過檢測電流的變化進行測定。該方法相對于核酸測序的傳統方法節省了大量時間和成本。

5、之前報道的蛋白納米孔，例如突變體mspa(manrao?et?al.,naturebiotechnology,2012,30(4),349-353)以及α-溶血素納米孔(nat.nanotechnol.,2009,4(4),265-70)已經用于使用“鏈測序”方法的核酸測序。相似地，對于蛋白傳感其他孔例如α-溶血素(j?am?chem?soc,2012,134(5),2781-7)和clya(am.chem.soc.nano.2014,8(12),12826-35)(j.am.chem.soc,2013,135(36),13456-63)也已經被采用。

6、對克服現有技術缺陷的新型納米孔的需求依然存在，尤其是優化用于分子傳感應用和例如核酸測序應用的孔的維度和特征。

7、納米孔傳感是一種依靠觀察個體結合或分析物分子和受體間相互作用的傳感方法。納米孔傳感器可以通過在絕緣膜中放置納米維度的單孔并測量在分析物分子存在下通過該孔的電壓驅動的離子傳輸而產生。分析物的識別通過其獨特的電流信號、顯著的持續時間和電流塊的范圍以及電流水平的變化顯示出來。

8、現在存在對快速且便宜、應用范圍廣泛的核酸(例如dna或rna)測序技術的需求。現有技術速度慢并且價格昂貴主要是因為其依賴擴增技術產生大量核酸并需要大量的用于信號檢測的專用熒光化學物質。納米孔傳感有潛力通過減少核苷酸和所需試劑用量而提供一種快速且便宜的核酸測序方法。

9、采用納米孔傳感進行核酸測序的兩個必要組分是(1)控制核酸移動通過該孔；和(2)核酸聚合物移動通過孔時對核苷酸的識別。在過去，為實現核苷酸的識別，使核酸穿過溶血素的突變體。這會提供電流信號，該電流信號顯示是由序列決定的。這也表明當使用溶血素孔時，大量的核苷酸有助于觀測電流，使得觀測電流和多核苷酸之間的直接關系令人深思。

10、雖然通過溶血素孔的突變已經改善了用于識別核苷酸的電流范圍，但是如果核苷酸之間的電流差異進一步提高，則測序系統將具有更好的性能。另外，觀察到，當核酸移動通過孔時，某些電流狀態表現出高變化性。還顯示，某些突變溶血素孔比其他的展現出更高的變化性。雖然這些狀態的變化可以包含序列的特異性信息，但是希望產生具有低變化性的孔來簡化該系統。還期望減少有助于觀測到的電流的核苷酸的數量。

技術實現思路

1、發明人已經鑒定出細菌淀粉樣蛋白分泌通道csgg的結構。所述csgg通道是一種跨膜寡聚蛋白，其形成最小直徑約為0.9nm的通道。csgg納米孔的結構使其適合用于蛋白質傳感應用中，特別是用于核酸測序。csgg多肽的修飾變體可以用于進一步增強所述通道對上述特定應用的適用性。

2、因為其結構更適合于dna測序應用，csgg孔較現有蛋白質孔例如clya或α-溶血素具有優勢。csgg孔具有更有利的縱橫比，包括比clya具有更短的跨膜通道。csgg孔與α-溶血素孔相比具有更寬的通道開口。對于某些應用，這可以促進酶的附著，例如對于核酸測序應用。在這些實施方式中，其也可以使位于酶和讀取頭(定義為孔的最窄部分)之間的核酸鏈段的長度最小化，從而導致改善的讀出信號。在涉及核酸測序的本發明的實施方式中，csgg孔的通道中狹窄的內部收縮結構(constriction)還促進單鏈dna的易位。所述收縮結構由兩個環形環組成，這兩個環形環通過相鄰蛋白質單體中位置51處的酪氨酸殘基(tyr?51)以及分別在位置56和55處的苯丙氨酸殘基和天冬酰胺殘基(phe?56和asn?55)并置而形成。所述收縮結構的尺寸可以被修改。clya具有更寬的內部收縮結構，使得目前沒有用于測序的雙鏈dna通過。所述α-溶血素孔不僅具有一個1.3nm寬的內部收縮結構，同時還具有一個2nm寬的具有額外讀取頭特征的β-桶結構。

3、在第一方面，本發明涉及一種用于分子傳感的方法，其包括：

4、a)提供一種由絕緣層內的至少一種csgg單體形成的csgg生物孔；

5、b)在所述絕緣層上施加電勢，從而建立通過所述生物孔的電流；

6、c)使所述csgg生物孔與測試底物接觸；以及

7、d)測量流過所述生物孔的電流。

8、典型地，所述絕緣層為一種膜，例如磷脂雙分子層。在一種實施方式中，通過所述孔的電流是由從所述絕緣層的第一側流到所述絕緣層的第二側的可溶性離子流攜帶。

9、在本發明的一種實施方式中，所述分子傳感為分析物檢測。在特定實施方式中，分析物檢測的方法包括在步驟(d)之后的另外的步驟：通過與測試底物不存在時通過所述生物孔的電流相比，通過所述生物孔的電流減少，確定出測試底物的存在。

10、在本發明一種替代的實施方式中，所述分子傳感是核酸測序。典型地，通過所述方法測序的核酸種類為dna或rna。在本發明特定的實施方式中，所述csgg生物孔適合于容納額外的輔助蛋白。典型地，所述額外的輔助蛋白為選自以下的核酸加工酶：dna或rna聚合酶；異構酶；拓撲異構酶；促旋酶；端粒酶；核酸外切酶；和解旋酶。

11、在本發明的實施方式中，所述csgg生物孔為一種修飾的csgg孔，其中所述修飾的csgg孔對所述csgg孔的至少一個csgg單體中的單體野生型大腸桿菌csgg多肽序列至少具有一種修飾。典型地，對形成所述csgg孔的所有csgg單體進行相同的修飾。在本發明具體的實施方式中，所述修飾的csgg單體具有根據seq?id?no：4至388的從位置38至63的多肽序列。

12、在第二方面，本發明涉及修飾的csgg生物孔，包括至少一個csgg單體，其中所述修飾的csgg生物孔具有不多于一個的通道收縮結構，所述收縮結構的直徑范圍為0.5nm至1.5nm。典型地，所述修飾在所述csgg單體多肽序列的位置38至63之間。合適的，所述修飾處于選自以下的位置：tyr51；asn55；和phe?56。在具體的實施方式中，所述修飾為在tyr?51位置，或在asn55和phe56兩個位置。

13、在本發明的實施方式中，對所述csgg單體的修飾選自以下：自然存在的氨基酸的取代；自然存在的氨基酸的缺失；和自然存在的氨基酸側鏈的修飾。合適地，所述修飾降低或除去未修飾氨基酸的空間阻礙。在具體的實施方式中，所述孔的至少一個csgg單體具有根據seq?id?no?4至388的從位置38至63的多肽序列。

14、在第三方面，本發明涉及分離的多肽，所述多肽編碼本發明第二方面的修飾的csgg生物孔的至少一種csgg單體。

15、在第四方面，本發明涉及分離的核酸，所述核酸編碼本發明第三方面的分離的多肽。

16、在第五方面，本發明涉及一種生物傳感器，包括：

17、a)絕緣層；

18、b)在所述絕緣層中的csgg生物孔；以及

19、c)用于測量通過所述生物孔電流的設備。

20、在具體實施方式中，在所述生物傳感器中的所述csgg生物孔為根據本發明第二方面所述的修飾的csgg生物孔。

21、在第六方面，本發明涉及用于生物傳感應用的csgg生物孔的用途，其中所述生物感應應用為分析物檢測或核酸測序。

22、本發明第六方面的一種實施方式中，所述核酸測序為dna測序或rna測序。

23、發明人意外地證明，csgg及其新突變體可用于表征分析物，例如多核苷酸。本發明涉及突變csgg單體，其中進行一個或多個修飾以提高所述單體與分析物，例如多核苷酸，相互作用的能力。發明人還意外的證明，包含新型突變單體的孔具有增強的與分析物，例如多核苷酸，相互作用的能力，并因此表現出用于評估分析物特性(例如多核苷酸序列)的改進的性能。所述突變孔意外的顯示出改善的對核苷酸的鑒別。特別地，突變孔意外的顯示出增加的電流范圍，這使其更容易區分不同的核苷酸，并減少會增加信噪比的狀態變化。另外，多核苷酸移動通過所述孔時促成電流的核苷酸數量降低。這使得確定多核苷酸移動通過孔時觀察到的電流與多核苷酸之間的直接關系更加容易。另外，所述突變孔可以顯示出增加的通量，例如，更可能與分析物，例如多核苷酸，相互作用。這使得采用所述孔表征分析物更加容易。所述突變孔可以更容易地插入膜。

24、因此，本發明提供一種包含seq?id?no：390所示序列變體的突變型csgg單體，其中所述變體包含在y51，n55和f56中的一個或多個位置處的突變。

25、因此，本發明提供一種包含seq?id?no：390所示序列變體的突變型csgg單體，其中所述變體包括以下的一種或多種：(i)在以下位置的一個或多個突變(即在一個或多個以下位置的突變)n40，d43，e44，s54，s57，q62，r97，e101，e124，e131，r142，t150和r192；(ii)在y51/n55，y51/f56，n55/f56或y51/n55/f56的突變；(iii)q42r或q42k；(iv)k49r；(v)n102r，n102f，n102y或n102w；(vi)d149n，d149q或d149r；(vii)e185n，e185q或e185r；(viii)d195n，d195q或d195r；(ix)e201n，e201q或e201r；(x)e203n，e203q或e203r；和(xi)一個或多個以下位置的缺失：f48，k49，p50，y51，p52，a53，s54，n55，f56和s57。

26、本發明還提供：

27、-包含兩個或多個共價連接的csgg單體的構建體，其中至少一個單體是本發明所述的突變型單體；

28、-編碼本發明突變型單體或本發明構建體的多核苷酸；

29、-一種衍生自包含本發明的相同突變型單體或本發明的相同構建體的csgg的同源寡聚孔；

30、-一種衍生自包含至少一個本發明突變型單體或至少一個本發明構建體的csgg的異源寡聚孔；

31、-用于確定目標分析物的存在、不存在或一種或多種特性的方法，包括：

32、a)將目標分析物與csgg孔或其突變體接觸，以使所述目標分析物相對于所述孔移動；和

33、b)所述分析物相對于所述孔移動時獲取一個或多個測量值并因此確定所述分析物的存在、不存在或其一種或多種特性；

34、-一種形成用于表征目標多核苷酸的傳感器的方法，包括形成csgg孔或其突變體和多核苷酸結合蛋白之間的復合物，并從而形成用于表征目標多核苷酸的傳感器；

35、-用于表征目標多核苷酸的傳感器，包括csgg孔或其突變體和多核苷酸結合蛋白之間的復合物；

36、-csgg孔或其突變體在確定目標分析物存在、不存在或一個或多個特性中的應用；

37、-一種用于表征目標分析物的試劑盒，包括(a)csg孔或其突變體，以及

38、(b)膜的組分；

39、-一種用于表征樣品中目標分析物的設備，包括(a)多個csgg孔或其突變體和(b)多個膜；

40、-表征目標多核苷酸的方法，包括：

41、a)使所述多核苷酸與csgg孔或其突變體、聚合酶和標記的核苷接觸，以使磷酸標記物(phosphate?labelled?specie)通過聚合酶順序添加到目標多核苷酸，其中所述磷酸標記物含有對每個核苷酸特異性的標記；以及

42、b)采用所述孔檢測所述磷酸標記物并從而表征所述多核苷酸；和

43、生產本發明所述突變單體或本發明所述構建體的方法，包括在合適的宿主細胞中表達本發明所述的多核苷酸并從而產生本發明所述的突變單體或構建體。