本發明涉及微生物工程領域，具體涉及一種甘草次酸生物傳感器及其應用。

背景技術：

1、甘草酸次是傳統中藥甘草的主要活性成分，是一種典型的五環三萜化合物，被廣泛應用于醫藥、食品、化妝品和保健品等領域。目前獲取甘草次酸的主要方法為從甘草的根部提取甘草酸，再經酸水解或酶水解得到甘草次酸，工藝包括干燥、研磨、粉碎、水解等多個步驟，生產工藝復雜；此外，甘草的根系發達，可防風固沙，具有重要的生態應用價值，“挖根提酸”的獲取模式嚴重破壞了甘草的植被分布和當地的生態環境，不利于環境保護。

2、近年來，合成生物學與代謝工程的發展賦予了微生物合成異源萜烯化合物的能力，同時利用微生物合成天然產物的優勢日益明顯，成為一種潛在的綠色環保的替代方法。科研人員已經構建了能夠合成甘草次酸的釀酒酵母細胞工廠，授權號：zl201610965315.9，同時迭代更新的組學技術、基因編輯技術和體外組裝技術地發展推動了細胞工廠的構建與優化，為進一步提高萜烯化合物的生產效率提供了有利條件。但是，目前甘草次酸的檢測方法主要依靠氣相色譜，需要對細胞樣品進行破碎、萃取、衍生化、色譜檢測等過程，步驟繁瑣、樣品處理效率低、重復性差，檢測過程已成為阻礙合成甘草次酸細胞工廠高通量構建與優化的最大瓶頸。

3、因此，相關技術中亟需一種快速、高通量的甘草次酸檢測方法。

技術實現思路

1、本發明至少從以下方面解決了相關技術的問題之一。

2、本申請第一方面實施例提供一種甘草次酸生物傳感器，包含：pdr5啟動子。

3、在一些實施例中，所述甘草次酸生物傳感器還包含報告基因。

4、在一些實施例中，所述報告基因是編碼熒光蛋白的基因或者編碼組氨酸合成酶的基因。

5、在一些實施例中，所述甘草次酸生物傳感器還包含：插入在pdr5啟動子中一個或多個位點的轉錄因子結合序列，其中所述轉錄因子結合序列選自由以下組成的組：第一基序(tccgcgga)、第二基序(ttactaa)和第三基序(cggaacga)。

6、在一些實施例中，所述一個或多個位點包括：第一位點、第二位點和第三位點，其中第一位點位于所述pdr5啟動子3’端起第501個至第525個核苷酸中的任一處，所述第二位點位于所述pdr5啟動子3’端起第374個至第419個核苷酸中的任一處，所述第三位點位于所述pdr5啟動子3’端起第92個至第239個核苷酸中的任一處。

7、在一些實施例中，所述第一位點位于所述pdr5啟動子3’端起第513個核苷酸處，所述第二位點位于所述pdr5啟動子3’端起第407個核苷酸處，所述第三位點位于所述pdr5啟動子3’端起第220個核苷酸處。

8、在一些實施例中，所述第一位點處無插入序列，或者所述第一位點處插入的第一序列為：第二基序、第三基序、第二基序與第三基序的組合。

9、在一些實施例中，所述第二位點處無插入序列，或者所述第二位點處插入的第二序列為：第一基序、第二基序、第三基序、第一基序與第三基序的組合、第二基序與第三基序的組合、第一基于與第二基序的組合、第一至第三基序的組合。

10、在一些實施例中，所述第三位點處無插入序列，或者所述第三位點處插入的第三序列為：第二基序、第三基序、第二基序與第三基序的組合。

11、在一些實施例中，所述一個或多個位點中的至少兩個位點插入有所述轉錄因子結合序列。

12、在一些實施例中，所述第一位點處無插入序列，或者所述第一位點處插入的第一序列為第一基序、第二基序。

13、在一些實施例中，所述第二位點處無插入序列，或者所述第二位點處插入的第二序列為：第一基序。

14、在一些實施例中，所述第三位點處無插入序列，或者所述第三位點處插入的第三序列為：第一基序。

15、在一些實施例中，所述一個或多個位點中的至少一個位點插入有述轉錄因子結合序列。

16、本申請第二方面實施例提供了包含上述第一方面任一實施例所述的甘草次酸生物傳感器的釀酒酵母。

17、在一些實施例中，所述釀酒酵母的出發菌株選自由以下組成的組：s288c、synv、ga183、ga184。

18、在一些實施例中，所述釀酒酵母不表達rna依賴的rna聚合酶(rdr1)和/或分子伴侶蛋白(ssz1)，其中編碼rdr1的基因的核苷酸序列如seq?id?no：8所示，編碼ssz1的基因的核苷酸序列如seq?id?no：9所示。

19、本申請第三方面實施例提供上述第一方面任一實施例所述的甘草次酸生物傳感器或者上述第二方面任一實施例所述的釀酒酵母在獲得高產甘草次酸的釀酒酵母中的應用。

20、與相關技術相比，本發明實施例至少實現了如下有益效果：

21、本發明實施例的甘草次酸生物傳感器對甘草次酸有較高的特異性響應并且該特異性響應可以通過在pdr5啟動子中插入轉錄因子結合序列來調節，該生物傳感器可以應用于甘草次酸高產菌株的高通量檢測和篩選，以及高產菌株的穩定遺傳和適應性進化。

22、本發明實施例的甘草次酸生物傳感器及其應用為高產甘草次酸的釀酒酵母菌種的快速選育提供了一種簡單且有效的方法。

技術特征：

1.一種甘草次酸生物傳感器，其特征在于，包含：pdr5啟動子。

2.根據權利要求1所述的甘草次酸生物傳感器，其特征在于，還包含報告基因。

3.根據權利要求2所述的甘草次酸生物傳感器，其特征在于，所述報告基因是編碼熒光蛋白的基因或者編碼組氨酸合成酶的基因。

4.根據權利要求1所述的甘草次酸生物傳感器，其特征在于，還包含：插入在pdr5啟動子中一個或多個位點的轉錄因子結合序列，其中所述轉錄因子結合序列選自由以下組成的組：第一基序(tccgcgga)、第二基序(ttactaa)和第三基序(cggaacga)。

5.根據權利要求4所述的甘草次酸生物傳感器，其特征在于，所述一個或多個位點包括：第一位點、第二位點和第三位點，其中第一位點位于所述pdr5啟動子3’端起第501個至第525個核苷酸中的任一處，所述第二位點位于所述pdr5啟動子3’端起第374個至第419個核苷酸中的任一處，所述第三位點位于所述pdr5啟動子3’端起第92個至第239個核苷酸中的任一處；

6.根據權利要求5所述的甘草次酸生物傳感器，其特征在于，所述第一位點處無插入序列，或者所述第一位點處插入的第一序列為：第二基序、第三基序、第二基序與第三基序的組合；

7.根據權利要求5所述的甘草次酸生物傳感器，其特征在于，所述第一位點處無插入序列，或者所述第一位點處插入的第一序列為第一基序、第二基序；

8.包含如權利要求1至7中任一項所述的甘草次酸生物傳感器的釀酒酵母。

9.根據權利要求8所述的釀酒酵母，其特征在于，所述釀酒酵母的出發菌株選自由以下組成的組：s288c、synv、ga183、ga184；

10.如權利要求1至7中任一項所述的甘草次酸生物傳感器或者如權利要求8或9所述的釀酒酵母在獲得高產甘草次酸的釀酒酵母中的應用。

技術總結
本發明涉及微生物工程領域，具體涉及一種甘草次酸生物傳感器及其應用。該甘草次酸生物傳感器包含PDR5啟動子。該甘草次酸生物傳感器對甘草次酸有較高的特異性響應并且該特異性響應可以通過在PDR5啟動子中插入轉錄因子結合序列來調節。該生物傳感器可以應用于甘草次酸高產菌株的高通量檢測和篩選，以及高產菌株的穩定遺傳和適應性進化。本發明實施例的甘草次酸生物傳感器及其應用為高產甘草次酸的釀酒酵母菌種的快速選育提供了一種有效方法。

技術研發人員：李春,秦磊
受保護的技術使用者：清華大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24