本發明涉及一株產高產阿魏酸酯酶的假單胞菌的篩選、鑒定及作為生物強化劑在發酵食品中的應用，屬于釀造。

背景技術：

1、黃酒是我國歷史最悠久的酒種之一，在中國釀造酒中占據重要位置。黃酒口感柔和，香氣淡雅，營養豐富，具有獨特的保健功能。麥曲，主要分為生麥曲和熟麥曲，是一種富含各種微生物和酶系的糖化發酵劑。目前我國黃酒中檢測出來的揮發性風味物質有975種，包括有酚類、醇類、酯類、醛類、酮類、縮醛類等，這些重要的揮發性化合物來自于原料、用曲、釀造用水甚至環境等各個方面。

2、阿魏酸(fa)是一種應用廣泛的羥基肉桂酸。各種科學研究表明，fa具有巨大的健康保護潛力，包括抗氧化、抗病毒、抗炎和血管功能益處。傳統發酵黃酒的fa含量約0.57～3.98mg/l，且fa作為一種前體物質其含量與發酵黃酒的原料以及用曲原料有關，像糯米中的多酚以不同的方式與支鏈淀粉和直鏈淀粉相互作用，影響且受α-淀粉酶水解；小麥外皮和麥麩中主要的酚酸化合物為阿魏酸。然而，阿魏酸通過醚鍵和酯鍵與纖維素、半纖維素和木質素交聯，使其難以釋放，因此選用高產阿魏酸酯酶、纖維素酶、木聚糖酶的麥曲對于提高發酵黃酒中fa的含量具有重要意義。此外fa在黃酒發酵過程中可由不同的微生物所分泌的酶可轉化為香蘭素、4-乙烯基愈創木酚、咖啡酸、香草酸等化合物豐富黃酒的香氣。

3、現有技術中，黃酒的阿魏酸含量過低，難以發揮阿魏酸的功能益處并提升黃酒香氣，提高黃酒中的阿魏酸含量對于提高黃酒的品質具有重要作用。

技術實現思路

1、基于現有技術問題與工藝問題，本發明旨在提供一株高產阿魏酸酯酶菌株、篩選方法以及應用。

2、一株高產阿魏酸酯酶的假單胞菌(pseudomonas?sp.)a-4h，已于2025年01月02日保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctcc?no:m?2025002，地址：中國，武漢，武漢大學。

3、在本發明的一種實施方式中，所述假單胞菌(pseudomonas?sp.)a-4h從麥曲中，經分離、純化和篩選驗證得到。

4、在本發明的一種實施方式中，所述篩選步驟為：

5、步驟一，麥曲的預處理

6、準確稱取10g麥曲樣品放入滅菌后的三角瓶中，添加90ml無菌生理鹽水并放入幾顆無菌的玻璃珠，在37℃恒溫水浴鍋中振蕩培養4h備用。

7、步驟二，菌株的分離與純化

8、取步驟一中經過預處理的的麥曲懸濁液進行10倍梯度稀釋4次，取103、104、105、106稀釋度菌懸液200μl涂布于阿魏酸酯酶固體篩選培養基上，置于37℃培養箱中倒置培養。挑選菌落形態外觀不同的單菌落在lb固體培養基上劃線進行進一步分離純化。

9、步驟三，產阿魏酸酯酶菌株的篩選及液態發酵驗證

10、將分離出的各菌種分別接種于阿魏酸酯酶液體篩選培養基中進行液態發酵產阿魏酸實驗，使用高效液相色譜測定阿魏酸的含量，將產阿魏酸能力最強的菌株命名為a-4h。

11、本發明提供了含有所述假單胞菌a-4h的微生物制劑。

12、在本發明的一種實施方式中，所述微生物制劑中，所述假單胞菌a-4h的菌體數不低于1×106cfu/ml或1×106cfu/g。

13、本發明提供了含有所述假單胞菌a-4h或所述微生物制劑的產品。

14、本發明提供了一種生產阿魏酸的方法，將所述假單胞菌a-4h假單胞菌a-4h，或所述微生物制劑添加至含有阿魏酸酯的環境中進行發酵。

15、在本發明的一種實施方式中，阿魏酸酯包括阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、低聚糖阿魏酸酯或多糖阿魏酸酯。

16、本發明提供了一種制備麥曲的方法，將所述假單胞菌a-4h與草酸青霉m1816同時接種于小麥、麩皮、大米、小米、玉米、糯米中的一種或多種中。

17、本發明提供了一種提高黃酒中阿魏酸含量的方法，將所述假單胞菌a-4h，或所述微生物制劑添加至黃酒原料中進行發酵。

18、在本發明的一種實施方式中，黃酒原料中還添加草酸青霉m1816。

19、在本發明的一種實施方式中，所述黃酒原料中，假單胞菌a-4h的添加量不低于1×106cfu/ml。

20、在本發明的一種實施方式中，所述黃酒原料中，添加的假單胞菌a-4h和草酸青霉m1816的菌體比值為(1～8):1。

21、在本發明的一種實施方式中，于15～28℃，發酵至少20天。

22、本發明提供了所述假單胞菌a-4h或所述微生物制劑在制備發酵食品中的應用。

23、有益效果：

24、本發明篩選得到一株高產阿魏酸酯酶的假單胞菌(pseudomonas?sp.)a-4h。所述假單胞菌a-4h在培養36h后能夠產生阿魏酸含量為153.79±2.36mg/l，發酵液中阿魏酸酯酶酶活達到136.63±10.27u/l；在黃酒的釀造中添加所述假單胞菌a-4h，可以有效提高黃酒中的阿魏酸含量、酚酸含量和有機酸含量，為增加釀造食品中阿魏酸含量提供了有效的生物途徑。

25、生物材料保藏

26、一株假單胞菌(pseudomonas?sp.)a-4h，分類學命名為：pseudomonas?sp.a-4h，已于2025年01月02日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctcc?no：m?2025002，保藏地址為中國，武漢，武漢大學。

技術特征：

1.一株假單胞菌(pseudomonas?sp.)a-4h，其特征在于，所述假單胞菌a-4h保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctcc?no:m?2025002，保藏日期為2025年01月02日。

2.含權利要求1所述假單胞菌a-4h的微生物制劑。

3.如權利要求2所述微生物制劑，其特征在于，所述微生物制劑中，所述假單胞菌a-4h的菌體數不低于1×106cfu/ml或1×106cfu/g。

4.含有權利要求1所述假單胞菌a-4h或權利要求2或3所述微生物制劑的產品。

5.一種生產阿魏酸的方法，其特征在于，將權利要求1所述假單胞菌a-4h，或權利要求2或3所述微生物制劑添加至含有阿魏酸酯的環境中進行發酵。

6.如權利要求5所述方法，其特征在于，所述阿魏酸酯包括阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、低聚糖阿魏酸酯或多糖阿魏酸酯。

7.一種制備麥曲的方法，其特征在于，將權利要求1所述假單胞菌a-4h與草酸青霉m1816同時接種于麥曲底物中，所述麥曲底物包括小麥、麩皮、大米、小米、玉米、糯米中的一種或多種。

8.一種提高黃酒中阿魏酸含量的方法，其特征在于，將權利要求1所述假單胞菌a-4h，或權利要求2或3所述微生物制劑添加至黃酒原料中進行發酵。

9.如權利要求8所述方法，其特征在于，黃酒原料中還添加草酸青霉菌m1816。

10.如權利要求9所述方法，其特征在于，所述黃酒原料中，假單胞菌a-4h的添加量不低于1×106cfu/ml。

11.如權利要求10所述方法，其特征在于，所述黃酒原料中，添加的假單胞菌a-4h和草酸青霉菌m1816的菌體比值為(1～8):1。

12.如權利要求10所述方法，其特征在于，于15～28℃，發酵至少20天。

13.權利要求1所述假單胞菌a-4h或權利要求2或3所述微生物制劑在制備發酵食品中的應用。

技術總結
本發明公開了一株產高產阿魏酸酯酶的假單胞菌的篩選、鑒定及作為生物強化劑在發酵食品中的應用，屬于釀造技術領域。本發明篩選得到一株高產阿魏酸酯酶的假單胞菌(Pseudomonas?sp.)A?4H。所述假單胞菌A?4H在培養36h后能夠產生阿魏酸含量為153.79±2.36mg/L，發酵液中阿魏酸酯酶酶活達到136.63±10.27U/L；在黃酒的釀造中添加所述假單胞菌A?4H，可以有效提高黃酒中的阿魏酸含量、酚酸含量和有機酸含量，為增加釀造食品中阿魏酸含量提供了有效的生物途徑。

技術研發人員：毛健,劉雙平,白曉麟
受保護的技術使用者：江南大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28