本發(fā)明涉及一種ythdf熒光探針，還涉及上述熒光探針的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、n6-甲基腺苷(m6a)是真核mrna和非編碼rna中最常見的修飾。它在20世紀(jì)70年代首次被發(fā)現(xiàn)并被認(rèn)為是細(xì)胞中mrna處理的潛在調(diào)節(jié)因子。m6a修飾能夠影響神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病、干細(xì)胞的自我更新和分化、腫瘤進(jìn)展和晝夜節(jié)律。這種甲基化修飾對于真核生物基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控至關(guān)重要，m6a通過影響細(xì)胞中mrna的剪接、核輸出、翻譯和穩(wěn)定性來發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。m6a修飾調(diào)控是動態(tài)且可逆的。m6a在rna上的豐度和效應(yīng)是由其甲基轉(zhuǎn)移酶、結(jié)合蛋白和去甲基化酶之間的動態(tài)相互作用決定的。m6a結(jié)合蛋白能夠識別并結(jié)合m6a位點，最終決定m6a修飾的mrna命運。這些蛋白特異性與m6a位點結(jié)合，并招募各種調(diào)節(jié)或功能蛋白來控制甲基化修飾mrna的命運。

2、目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多不同類型的m6a閱讀器，其中yth結(jié)構(gòu)域是m6a最常見的“閱讀子”，能夠直接與m6a結(jié)合。含yth結(jié)構(gòu)域的蛋白參與rna剪接、核輸出、mrna翻譯和衰變生物過程。人細(xì)胞中含yth結(jié)構(gòu)域的蛋白分為三類，yth結(jié)構(gòu)域蛋白1、yth結(jié)構(gòu)域蛋白2和yth結(jié)構(gòu)域家族(ythdf)。ythdf蛋白有三個成員(ythdf1,ythdf2,ythdf3)，三個成員間高度同源，整體氨基酸長度相近。功能上，ythdf蛋白是人細(xì)胞質(zhì)中的主要“閱讀子”。ythdf蛋白通過m6a修飾與mrna結(jié)合，對mrna的翻譯、和穩(wěn)定性有重要影響，它在多種生理過程中發(fā)揮重要作用，包括干細(xì)胞分化、神經(jīng)發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等。

3、目前，僅有幾個ythdf小分子抑制劑被報道，如ebselen、dc-y13-27等，且都存在抑制活性較差、成藥性較差的缺點。并且至今未有ythdf小分子抑制劑進(jìn)入臨床階段，仍然需要開發(fā)新型的ythdf小分子抑制劑。因此體外抑制活性測試方法以及高通量篩選方法對ythdf小分子抑制劑的發(fā)展至關(guān)重要。準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠的活性測試方法有助于發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的先導(dǎo)化合物，指導(dǎo)先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化以及獲得活性更優(yōu)的候選藥物分子，為靶向ythdf治療藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

4、熒光偏振(fluorescence?polarization?assay,fp)原理是用平面偏振光激發(fā)小的熒光標(biāo)記分子(探針)時，因為游離探針快速地翻轉(zhuǎn)，它發(fā)出的發(fā)射光去偏振程度高。但當(dāng)探針結(jié)合一個比之大得多的分子時，它的旋轉(zhuǎn)速度就會變慢，同時發(fā)射光有大部分產(chǎn)生偏振。fp被用于檢測各種分子之間的相互作用，例如蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸、受體與配體之間的相互作用。fp檢測不需要分離束縛配體和自由配體。這使得配體結(jié)合可以在不擾動平衡的情況下進(jìn)行量化，使其適合于測量低親和相互作用，目前尚未研發(fā)出高通量、經(jīng)濟(jì)和快速的ythdf蛋白篩選方法，適于作為ythdf熒光探針的化合物仍亟待開發(fā)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種具有特異性結(jié)合且具有熒光特性的ythdf熒光探針，還提供上述ythdf熒光探針的制備方法和應(yīng)用，為后續(xù)靶向ythdf藥物的高通量篩選提供了基礎(chǔ)。

2、技術(shù)方案：本發(fā)明公開了一種ythdf熒光探針，化學(xué)式為5'-fam-ccgg(m6a)cugu，結(jié)構(gòu)為式i所示：

3、

4、其中，c為胞嘧啶核糖核苷酸、g為鳥嘌呤核糖核苷酸、u為尿嘧啶核糖核苷酸、m6a為n6-甲基腺苷。

5、上述ythdf熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

6、(1)使用固相肽合成技術(shù)合成目標(biāo)rna序列ccgg(m6a)cugu；

7、(2)將5'-fam與rna序列ccgg(m6a)cugu進(jìn)行酰胺縮合反應(yīng)，得到粗產(chǎn)物；

8、(3)使用高效液相色譜或spps系統(tǒng)對標(biāo)記后的rna進(jìn)行純化，去除未反應(yīng)的5'-fam和副產(chǎn)物，即得ythdf熒光探針。

9、其中，步驟(1)中，所述固相肽合成技術(shù)，采用的固相載體為控制孔徑玻璃球cpg，合成單元為a、u、c、g四種亞磷酰胺單體；

10、其中，步驟(1)中，所述固相肽合成技術(shù)，包括脫保護(hù)、縮合、氧化和蓋帽四個反應(yīng)循環(huán)。

11、其中，步驟(1)中，固相合成完成后，引入m6a修飾的亞磷酰胺單體，將合成柱轉(zhuǎn)至離心管，加入氨氣甲醇溶液進(jìn)行氨解，氨解處理結(jié)束后加入脫保護(hù)試劑二甲基乙醇胺氫氟酸鹽，以除去rna上叔丁基二甲氧基硅基tbdms保護(hù)基。

12、其中，步驟(2)中，所述酰胺縮合反應(yīng)的溫度為室溫，反應(yīng)時間為12～24h。

13、其中，步驟(2)中，所述酰胺縮合反應(yīng)，采用的有機(jī)溶劑為四氫呋喃、乙腈、n，n-二甲基甲酰胺或二甲亞砜中的一種或幾種，采用的縮合劑為2-(7-氮雜苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯hatu、苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯hbtu、1-羥基苯并三唑hobt、n-羥基-7-氮雜苯并三氮唑hoat、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷bop中的一種或幾種。

14、上述ythdf熒光探針還可以應(yīng)用在ythdf蛋白配體篩選中。

15、其中，所述應(yīng)用為，將ythdf熒光探針、包含yth結(jié)合域的蛋白和待測化合物混合得混合物；利用熒光偏振技術(shù)測定混合物的偏振值，根據(jù)偏振值確認(rèn)待測化合物為ythdf蛋白的配體。

16、其中，當(dāng)偏振值降低大于檢測窗的25％即可判定待測化合物為ythdf蛋白的配體。

17、其中，所述應(yīng)用，采用的緩沖溶液為硼酸硼砂緩沖液na2b4o7-h3bo3、三羥甲基氨基甲烷緩沖液tris、磷酸鹽緩沖液pbs或n-2-羥乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸緩沖液hepes；優(yōu)選為na2b4o7-h3bo3；緩沖液體系的ph為7.4～7.8，優(yōu)選為7.4；緩沖溶液離子強(qiáng)度為50～100mm，優(yōu)選為50mmna2b4o7-h3bo3加50mm?kcl溶液；探針濃度90～120nm，優(yōu)選為110nm。

18、發(fā)明原理：本發(fā)明的ythdf熒光探針，采用了自動化的固相合成手段進(jìn)行rna序列的合成，解決了化學(xué)穩(wěn)定性、序列特異性、純度及產(chǎn)量的問題；采用模塊化合成策略，對每一步反應(yīng)條件和產(chǎn)率進(jìn)行精確控制，降低了副產(chǎn)物的合成與合成難度。

19、實驗表明，本發(fā)明的探針分子不僅保持了原有的特異性結(jié)合能力，與單獨的5'-fam相比，rna序列的引入優(yōu)化了分子內(nèi)電子傳遞過程，使得熒光發(fā)射效率得到提升。此外，本發(fā)明特選了na2b4o7-h3bo3緩沖溶液，提供了一個穩(wěn)定的化學(xué)環(huán)境；特選了體系的ph(7.4～7.8)，保證熒光探針與靶蛋白的高效結(jié)合且抑制副反應(yīng)的發(fā)生；特選了離子強(qiáng)度范圍(50～100mm)，促進(jìn)探針分子與靶標(biāo)的有效碰撞并保證體系穩(wěn)定性與均一性；特選了探針濃度(90～120nm)，既能與蛋白充分結(jié)合又避免了非特異性吸附帶來的干擾。綜上，本發(fā)明的熒光探針5'-fam-ccgg(m6a)cugu具有熒光特性，對ythdf有較好的特異性結(jié)合。將該化合物作為熒光偏振探針，通過競爭的方法，可以實現(xiàn)對ythdf配體的篩選及配體親和力水平的評價。基于本發(fā)明建立的篩選方法得到y(tǒng)thdf蛋白的熒光探針，為后續(xù)靶向ythdf藥物的高通量篩選提供了基礎(chǔ)。

20、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點：(1)本發(fā)明的ythdf熒光探針具有熒光特性，對ythdf有較好的特異性結(jié)合；(2)將該化合物作為熒光偏振探針，采用熒光偏振技術(shù)，可以實現(xiàn)對ythdf配體的篩選及配體親和力水平的評價，通過熒光偏振建立的一種ythdf小分子高通量篩選方案可以用于藥物的高通量篩選，具有廉價，穩(wěn)定，快速，高效等特點。