本發明屬于天然藥物活性開發和應用，具體涉及一種人參皂苷rh4的制備方法及其在生精障礙藥物中的應用。

背景技術：

1、近年來，男性的精液質量明顯下降，男性不育癥的發病率逐步上升。然而，人們多關注環境污染物及感染等因素對男性生殖的影響，而對環境溫度升高及生活方式改變對男性生殖發育和功能的影響并未受到充分重視。而精子發生是一個溫度依賴性的過程，精原細胞對精子的形成及維持精子數量穩定起著決定性的作用，對溫度要求極其敏感，據研究表明，男性睪丸溫度比核心體溫低2-8℃，這對于陰囊內維持精子的發生是最佳條件，也是睪丸生長必需條件之一(詳見salonia?a,et?al.european?association?of?urologyguidelines?on?sexual?and?reproductive?health—2021update:male?sexualdysfunction[j].european?urology,2021,80(3):333-357；zaha?i,et?al.the?role?ofoxidative?stress?in?infertility[j].journal?of?personalized?medicine,2023,13(8):1264)。

2、研究表明，睪酮(testosterone)與支持細胞分泌的雄激素受體(ar)的結合是啟動精子發生所必需的。在此過程中任何結構和功能的破壞都可能導致生精損傷。熱應激(hs)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(dehp)是現代生活中經常接觸到的，后者是環境內分泌干擾物之一，被廣泛應用于醫藥制造和塑料制品的生產中，與人們的生活息息相關。不育癥作為影響全球性的生殖系統疾病，已經成為很多育齡人群的困擾，與過去相比，男性不育主要表現為生精功能障礙(詳見：凌曉輝,等.小鼠睪丸支持細胞參與精子發生障礙的單細胞轉錄組研究[j].中國男科學雜志,2024,38(04):38-47；魏錦濤,等.中藥調控鐵死亡途徑干預睪丸生精上皮損傷的研究進展[j].中華男科學雜志,2024,30(05):450-455)。hs和dehp及其代謝產物誘導的生精損傷或許與男性不育癥的病理因素有關。而當前醫藥健康領域針對外界環境以及化學因素所致的生精障礙尚無相關研究報道，因此，從中藥中尋求天然有效的活性成分緩解生精損傷，改善生殖功能有較好地應用潛力。

3、人參是我國傳統中草藥，因其良好地藥理作用，且副作用相對較小而被廣泛應用，近年來人參及其皂苷類成分對生殖系統疾病的保護作用成為人們的關注點。人參皂苷rh4是人參中較為重要的活性成分，但由于人參皂苷rh4分離、純化工藝復雜，而且消耗較為嚴重，成本較大，限制了其在醫藥健康領域中的應用。在現有技術中，cn?106046096?a公開了一種利用三醇組人參皂苷大規模轉化生產人參皂苷rh4的方法，涉及發酵罐和系列有機酸反應，不僅工藝復雜，存在安全性問題，而且人參皂苷rh4純度不高。cn?103193846?a公開了一種人參皂苷rk3和人參皂苷rh4順反異構體的制備方法，聯用硅膠柱色譜和高速逆流分離，得到人參皂苷rk3、z型人參皂苷rh4和e型人參皂苷rh4，三個化合物純度均大于95％，該方法雖能有效分離人參皂苷rk3和rh4，但其產量極低，且工藝復雜，成本較高，不適合工業化生產。cn?118773172?a公開了一種大規模生產稀有人參皂苷rh4的方法，采用β-葡萄糖苷酶變體作為催化劑，催化人參皂苷rg1經由人參皂苷rh1轉化為人參皂苷rh4，純化后人參皂苷rh4的純度≥95％，適合大規模生產，但該方法以人參皂苷rg1為原料，而人參皂苷rg1盡管在人參中含量較高，但分離過程繁瑣，且容易造成資源的浪費，這不利于人參的可持續發展。而且當前人參皂苷rh4在防治生精障礙中的應用尚未報道。

4、綜上所述，目前關于人參皂苷rh4的制備方法大多數集中在利用三醇組人參皂苷，通過酸轉化的方式，再進一步利用系列分離手段進行純化。該過程不僅操作，而且易造成資源浪費，尤其人參三醇組皂苷轉化成人參皂苷rh4過程中，會不可避免地產生人參皂苷rg6、f4和rk3等副產物，分離過程極為繁瑣。本發明的優勢在于，利用溫和堿水解的方法，以金屬離子為催化劑，從人參莖葉皂苷中高效定向轉化為人參皂苷rh4，本發明具有工藝簡單，經濟、安全以及產率高的特點，而且體內外實驗證明，本發明所制備的人參皂苷rh4在制備生精障礙藥物或保健品中有廣泛的應用潛力，創造性提出且證明人參皂苷rh4是非常具有開發前景的生精損傷保護劑，可應用于治療和預防外界環境熱應激、化學等系列因素所致的生精障礙等問題，實用性強，開發前景廣闊。

技術實現思路

1、本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術的不足，提供一種人參皂苷rh4的制備方法及其在生精障礙藥物中的應用。本發明以人參莖葉總皂苷為底物，以碳酸氫氨(nh4hco3)水溶液或碳酸氫鈉(nahco3水溶液為溶劑，bacl2為催化劑，采用溫和堿水解的方法，實現了人參三醇型皂苷的高效定向轉化，通過“一步轉化，一步萃取和分離”的方法高效制備人參皂苷rh4，并且揭示其在制備治療和預防生精障礙藥物及保健品中的應用，與生活息息相關，更是拓寬人參在醫藥健康領域的應用范圍，有顯著的實用性和開發潛力。

2、為充分證明本發明的優越性，解決當前人參皂苷rh4分離復雜，資源浪費嚴重等技術，本發明采用的技術方案是：

3、一種人參皂苷rh4的制備方法，該方法包括以下步驟：

4、s1、以質量分數為10％～40％的nh4hco3水溶液或nahco3水溶液為溶劑，在攪拌的條件下加入人參莖葉總皂苷，然后再加入金屬離子(bacl2)作為催化劑，置于溫度為65～75℃的水浴中反應4～6h，靜置冷卻后，得到反應液，將反應液用水飽和正丁醇溶液進行萃取得到人參皂苷rh4粗品；

5、s2、將s1得到的人參皂苷rh4粗品經硅膠柱層析或半制備液相色譜進行分離純化，得到高純度的人參皂苷rh4。

6、優選地，s1中所述人參莖葉總皂苷與nh4hco3水溶液或nahco3水溶液的比例為1:20。

7、優選地，s1中所述bacl2占人參莖葉總皂苷質量的2％～8％。

8、優選地，s1所得的人參皂苷rh4粗品中人參皂苷rh4的含量為60％～75％。

9、優選地，s2中所述半制備液相色譜純化的色譜條件為：固定相為十八烷基鍵合硅膠，流動相為甲醇和水，進行等度洗脫。

10、優選地，s2所制備的人參皂苷rh4的純度≥98％。

11、本發明中人參莖葉總皂苷提取物可通過浸泡提取、回流提取、超聲提取、逆流提取和超臨界萃取等方式得到，所用提取劑為低級醇水溶液或低級酮，低級醇包括甲醇、乙醇、正丁醇，低級酮為丙酮。

12、本發明還提供了一種人參皂苷rh4在制備治療或預防生精障礙藥物和保健品中的應用。

13、所述人參皂苷rh4用于制備治療或預防生精障礙藥物和保健品時，還可以與其他活性成分或藥學上可接受的載體組合。

14、其中，活性成分為甘草提取物、麥冬提取物、薄荷提取物、維生素c及其衍生物或維生素e及其衍生物中的一種或多種。

15、本發明的人參皂苷rh4用于制備治療或預防生精障礙藥物時，可制成片劑、膠囊劑、散劑、注射劑、軟膠囊、丸劑，糖漿劑，顆粒劑和膏劑等，口服或胃腸外給藥。

16、所述治療或預防生精障礙藥物或保健品中核心成分人參皂苷rh4的含量為2.0％～45.0％，進一步優選為5.0％～20.0％。

17、上述人參皂苷rh4含量是治療熱應激(hs)以及化學(dehp)所致的生精損傷的有效量優選，也可根據給藥途徑和制劑的性質、接受者的體重、年齡等一般情況以及所治療疾病的性質和嚴重程度進一步調整。

18、本發明由于采用了以上技術方案，具有顯著的技術效果：

19、1、本發明以人參莖葉總皂苷為底物，以碳酸氫氨或碳酸氫鈉水溶液為溶劑，bacl2為催化劑，采用溫和堿水解的方法，明晰了三醇型人參皂苷rg1→rh4高效定向的轉化機理，實現了人參三醇型皂苷的高效定向轉化，通過“一步轉化，一步萃取和分離”的方法高效制備人參皂苷rh4，具有以下優勢：(1)反應底物來源廣泛，利用廉價易得的人參屬總皂苷進行直接水解，嚴格控制酸度與轉化時間，最大限度保證人參屬總皂苷轉化完全，提高人參皂苷rh4的產率；(2)金屬離子bacl2作為催化劑，有效降低碳酸氫氨/碳酸氫鈉的使用量，并促進人參三醇型皂苷的轉化效率，極大地提高了反應效率和產率；(3)工藝簡單，不必預先分離二醇型和三醇型皂苷，減少大孔樹脂、硅膠的使用，利用弱堿性轉化人參皂苷，促進人參三醇型皂苷的轉化，直接從反應液中萃取人參皂苷rh4；(4)可以有效減少人參皂苷rk3、rh4順反異構體對其純度的影響，通過硅膠柱層析或半制備液相高效分離得到高純度人參皂苷rh4，可有效節省人參皂苷rh4的分離純化時間。本發明的制備方法具有經濟、安全、簡單以及產率高的特點，適合于大規模工業化生產，能有效促進人參非藥用部位總皂苷的高效利用，促進人參可持續健康發展。

20、2、本發明提供了人參皂苷rh4在制備治療或預防生精障礙藥物及保健品中的應用。通過體內外實驗，充分證明人參皂苷rh4在治療熱應激以及化學因素所致的生精損傷方面有獨特的藥理作用，效果顯著，創造性地提出人參皂苷rh4可用于治療和預防環境熱應激、化學因素所致的生精障礙問題，具有較強的實用性，揭示了人參皂苷rh4是一種非常有前途和開發潛力生精損傷保護劑，實用性強，藥用價值突出，可以有效推動人參屬總皂苷的高效利用及其在制備醫藥健康領域方面中的應用。

21、下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明。