本發(fā)明涉及藥物遞送領域，具體涉及一種修飾磷脂的方法及其在制備靶向肝臟脂質體的應用。

背景技術：

1、dspe-peg2000是一種兩親性(親水和親油)分子，廣泛用于納米藥物載體、藥物遞送系統(tǒng)和生物醫(yī)學研究中。它的全稱是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇-2000，其中，dspe(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)是一種磷脂，具有疏水的脂肪鏈(硬脂酸)部分，能插入到脂質雙層中。peg2000(polyethylene?glycol2000)是分子量為2000的聚乙二醇部分，具有親水性，使其能夠穩(wěn)定懸浮在水中。dspe-peg2000常用于制備脂質體、納米顆粒和其他藥物遞送系統(tǒng)，特別適合在體內血液循環(huán)中延長藥物載體的壽命，并提高靶向性。peg鏈可以防止免疫系統(tǒng)識別和清除載體，因此有助然而，在用于靶向肝臟的脂質體中，dspe-peg2000也存在一些不足之處，包括：1)肝臟靶向效率低，peg修飾雖然能延長脂質體的循環(huán)時間，但同時也會減少脂質體與肝臟細胞的特異性結合。peg的“隱形”效應會降低脂質體被肝臟kupffer細胞或肝實質細胞識別的能力，從而降低肝臟靶向效率。2)抗體依賴的免疫激活，peg分子可能誘導產生抗peg抗體(anti-pegantibodies,apas)，導致免疫系統(tǒng)對脂質體的清除增加，這一現(xiàn)象被稱為加速血液清除效應(abc效應)，可能進一步影響肝臟的靶向性能。3)“橋效應”對細胞攝取的阻礙，dspe-peg2000由于peg鏈的空間位阻，可能在脂質體表面形成物理屏障，阻礙肝細胞對脂質體的有效攝取。4)血液中的蛋白冠效應，peg化的脂質體在血液中會吸附特定的血漿蛋白(如opsonin)，這些蛋白可能會改變脂質體的生物分布，從而影響肝臟的靶向性。5)peg脫落問題，在某些生理條件下，dspe-peg2000中的peg鏈可能脫落，導致脂質體失去長循環(huán)特性并加速被非特異性組織吸收。

2、而通常對于dspe-peg的進一步修飾是解決上述缺陷的技術手段。膽酸鈉是一種親水性膽酸，與腸上皮細胞表面過表達的asbt以及肝細胞表面的ntcp受體靶向結合，通過膽酸-asbt或膽酸-ntcp途徑發(fā)揮受體介導的內吞作用，繼而增強納米脂質體穿透腸道以及肝臟靶向能力。甘露糖可以與肝臟巨噬細胞表面的甘露糖受體特異性結合，將脂質體靶向至肝臟中的巨噬細胞。

3、本發(fā)明將在現(xiàn)有技術缺陷的基礎上對dspe-peg形成的脂質體在靶向性方面進行研究探討。

技術實現(xiàn)思路

1、為解決上述的技術問題，本發(fā)明選擇將膽酸鈉和甘露糖修飾在納米脂質體的表面，構建具有肝臟靶向性的口服遞送系統(tǒng)。

2、定義說明：

3、dspc:是指1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，中文名為1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿，簡稱二硬脂酰磷脂酰膽堿。它是一種常用于制備脂質體和納米藥物遞送系統(tǒng)的磷脂；

4、dspe-peg2000-nh2:1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[poly(ethylene?glycol)-2000]-ammonium，簡稱二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基；這是一種常用于藥物遞送系統(tǒng)(如脂質體、納米粒子等)中的修飾型磷脂，廣泛應用于靶向藥物遞送和基因治療。它的氨基(nh2)可以用來與其他分子或目標配體進行共價連接，提高靶向性和治療效果。

5、dspe-peg-ca:二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇-膽酸，由于合成反應中的peg為peg2000，因此，本發(fā)明說明書中出現(xiàn)的dspe-peg-ca即為dspe-peg2000-ca；

6、dspe-peg-man:二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇甘露糖，由于合成反應中的peg為peg2000，因此，本發(fā)明說明書中出現(xiàn)的dspe-peg-man即為dspe-peg2000-man。

7、dc-膽固醇(dc-chol，3β-[n-(n′,n′-二甲氨基乙基)氨基甲酰基]膽甾醇)是一種基于膽固醇的陽離子脂質，常用于基因轉染和遞送系統(tǒng)。它的結構特點是將膽固醇分子修飾為帶有陽離子胺基的衍生物，從而賦予其與負電荷核酸(如dna或rna)結合的能力。

8、具體的：

9、本發(fā)明的第一個方面是提供一種修飾磷脂的方法，其中，所述的方法為利用膽酸鹽修飾dspe-peg2000,其特征在于，所述的方法包括：

10、1)活化膽酸：將膽酸，1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺甲碘鹽(edc)和n-羥基丁二酰亞胺(nhs)溶解在二氯甲烷中，冰浴反應后，室溫攪拌過夜，過濾旋蒸后得到活化的膽酸鈉；

11、2)將dspe-peg2000-nh2溶解在dmso中，加入活化后的膽酸鈉和三乙基胺完全溶解后，反應；

12、3)反應結束后，將溶液置于透析袋中，以純水為介質透析；

13、4)透析結束后，收集透析袋中的溶液并凍干，得到dspe-peg-ca。

14、進一步地，其中步驟1)冰浴反應為20～40min；

15、進一步地，步驟2)dspe-peg2000-nh2與dmso以及添加配比為450～550mg：3ml；

16、進一步地，活化膽酸鈉與三乙基胺的添加比例為500～600mg：1g；

17、進一步地，反應溫度為38～45℃反應1～3h；

18、進一步地，其中步驟3)中透析袋的分子篩大小為mw＝800～1200da，透析時間為18～28h。

19、本發(fā)明第二方面提供一種修飾的磷脂dspe-peg-ca，其特征在于，所述的dspe-peg-ca由本發(fā)明第一個方面所述的方法制備獲得。

20、本發(fā)明第三個方面是提供一種修飾磷脂的方法，其中，所述的方法為利用甘露糖修飾dspe-peg2000,其特征在于，所述的方法包括：

21、1)將dspe-peg2000-nh2溶解在dmso中，加入甘露糖和三乙基胺完全溶解，以及甘露糖與三乙基胺，反應；

22、2)反應結束后，將溶液置于透析袋中，以純水為介質透析；

23、3)透析結束后，將透析袋中的溶液凍干，得到dspe-peg-man。

24、進一步地，其中步驟1)dspe-peg-nh2與dmso以及添加配比為450～550mg：3ml；

25、進一步地，甘露糖與三乙基胺的添加比例為500～600mg：1g；

26、進一步地，反應溫度為38～45℃反應1～3h；

27、進一步地，步驟2)透析袋的分子篩大小為mw＝800～1200da，透析時間為18～28h。

28、本發(fā)明第四個方面是提供一種修飾的磷脂dspe-peg-man，其特征在于，所述的dspe-peg-man由本發(fā)明第三個方面所述的方法制備獲得。

29、本發(fā)明第五個方面是第二個方面所述的dspe-peg-ca和第四個方面所述的dspe-peg-man在制備靶向肝臟脂質體的應用，所述的應用包括如下步驟：

30、(1)依次加入以下原料：dspc、膽固醇、dspe-peg-ca、dspe-peg-man、dspe-peg-nh2、dc-膽固醇，混勻后用微量玻璃注射器轉移至圓底燒瓶中，預先混勻后，在恒溫搖床中搖勻，使所有試劑熱力學分布均勻，此時溶液完全澄清；

31、(2)高壓旋蒸，得到厚度一致且分布均勻的膜；

32、(3)向步驟(3)形成的膜中加入緩沖液，超聲獲得溶液；

33、(4)用微量玻璃注射器吸取步驟(3)獲得的溶液，在脂質體擠出器中來回擠壓，擠壓結束的脂質體，過夜，使脂質體顆粒穩(wěn)定。

34、進一步地，其中步驟(1)各個組分的重量配比為：22.5％～44.25％的dspc、12.5％～31.5％的膽固醇、1％～10％的dspe-peg-ca、1％～10的10％?dspe-peg-man和30％的dc-膽固醇。

35、進一步地，其中，步驟(2)的操作為在壓強400～600mbar轉速80～120rpm溫度45～50℃條件下進行旋蒸。

36、本發(fā)明第一方面所述的方法制備獲得的dspe-peg-ca和第三方面所述的方法制備獲得的dspe-peg-ca在制備包埋治療非酒精性脂肪肝的藥物中載體中的應用。

37、本發(fā)明的有益效果包括：

38、1)首次合成脂質體組成的兩種原料dspe-peg2000-ca和dspe-peg2000-man后，與膽固醇、dspc、dc-膽固醇按照一定比例獲得了具有肝臟靶向性的脂質體；

39、2)本發(fā)明合成五種脂質體對心肌細胞h9c2、腸道上皮細胞caco-2、肝臟巨噬細胞kupffer及肝細胞aml-12無明顯毒性，適宜作為具有較高細胞安全性的乙酸鈉口服納米載體；

40、3)膽酸鈉/甘露糖雙標記熒光脂質體在肝臟中的熒光強度顯著高于單標記或無標記的脂質體，說明本實驗合成的膽酸鈉/甘露糖脂質體是一種具有儲存穩(wěn)定性、細胞安全性、穿透腸道上皮屏障及肝臟靶向的乙酸鈉口服遞送納米材料；

41、4)含乙酸鈉的膽酸鈉/甘露糖雙標記脂質體有效緩解了nafld細胞的脂質沉積及細胞炎癥；

42、5)小鼠灌胃雙標記乙酸鈉脂質體后，肝臟脂質沉積明顯改善，顯著激活肝臟ampkα蛋白磷酸化水平，通過抑制acc1、srebf1的轉錄，促進cpt1α表達，進而調控下游脂質代謝基因，有效減少肝臟脂質沉積。在肝臟炎癥水平和氧化應激方面，nafld小鼠灌胃10周雙標記乙酸鈉脂質體后，顯著抑制nfκb蛋白磷酸化，減少下游炎癥因子的釋放，有效緩解肝臟炎癥和氧化應激。