本發明涉及基因工程和酶工程，具體涉及通過基因工程改造得到的可以高效生產新穎drimane型倍半萜化合物的ii型倍半萜環化酶ssdms。

背景技術：

1、drimane型倍半萜化合物是一類具有獨特反式十氫萘雙環骨架的天然產物，由三個異戊二烯單元構成，具有如抗真菌、抗細菌和抗病毒、細胞毒活性等豐富的生理活性，對于臨床研究具有重大的意義。其中drimenol具有抗菌、抗氧化等活性，且在化學合成中是多種活性化合物如水蓼二醛、降龍涎香醚的合成子，其同分異構體albicanol是一種細胞毒性劑，具有強大的抗氧化、抗重金屬毒性的作用。然而，在自然界中這類化合物含量較少，靠傳統的原材料提取分離難以支撐其后續功能產品開發；在化學合成方面，該類倍半萜化合物現有的化學合成存在步驟繁瑣、環境不友好等問題，利用大腸桿菌高效生產該類化合物是非常經濟有效的方法。

2、傳統萜類生物合成系統催化效率較低，難以實現新穎drimane型倍半萜化合物的高效生產。目前在大腸桿菌中對于drimane型化合物的生產已有人工“兩步法”萜類生產途徑在大腸桿菌中高產drimenol的研究工作，其通過優化菌株實現了455.6mg/l的發酵產量。然而，該工作目前僅可專一高效生產drimenol，未能完成對其他drimane型化合物的生產，且缺乏系統的ssdms改造策略，難以定向獲得具有新穎催化功能的突變體。前期研究人員對ii型二萜環化酶atcps的突變改造發現，該酶的突變體h263a和n322a可產生羥基化和雙鍵異構的產物，突變體h263y可產生重排產物(-)-kolavenyldiphosphate，證明對ii型萜類環化酶活性空腔的改造可能會產生新的催化產物。

3、申請人研究發現，通過對ii型萜類環化酶ssdms活性空腔的關鍵氨基酸進行突變實驗可以部分或完全改變該酶的催化活性，使其生成結構多樣的drimane型重排產物，進一步豐富ssdms的催化產物多樣性，實現如albicanol、bicyclofarnesol、drimane-8α，11-diol等化合物的高效生產，對具有復雜結構和良好生理活性的drimane型化合物的藥物開發具有重要意義。

技術實現思路

1、發明目的：本發明提供一種基于丙氨酸掃描的ssdms定向進化策略，獲得能夠催化生成新穎drimane型倍半萜化合物的突變體，為后續藥物開發提供更多候選化合物；本發明的另一個目的是提供一種可以實現ssdms突變體異源表達和新穎drimane型倍半萜化合物高效生產的大腸桿菌細胞工廠。

2、技術方案：ssdms酶突變體，將氨基酸序列如seq?id?no：1所示的ssdms酶其中第208位氨基酸由天冬酰胺變成甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸，第248位氨基酸由苯丙氨酸變成甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或組氨酸，第249位氨基酸由異亮氨酸變成丙氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸或組氨酸，第497位氨基酸由谷氨酰胺變成甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酸，第505位氨基酸由酪氨酸變成丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或組氨酸。

3、所述ssdms酶是來源于細菌streptomyces?showdoensis的ii型萜類環化酶。

4、所述ssdms酶突變體是通過定點突變方法得到的。

5、一種ii型萜類環化酶ssdms酶的定向進化方法，通過ssdms酶與底物復合物的蛋白質共晶結構搜索活性空腔底物附近范圍內的氨基酸進行丙氨酸掃描，對有新穎活性的突變位點進行飽和突變。

6、所述的ssdms酶突變體在生物合成萜類化合物中的應用。

7、一種改造ii型萜類環化酶ssdms定點突變位點的高效融合表達載體，它是將水解酶及所述ssdms酶突變體融合的表達載體；其中，水解酶及所述ssdms酶突變體融合的氨基酸序列是將如seq?id?no：3所示的氨基酸序列中第397位由天冬酰胺變成甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸，第437位由苯丙氨酸變成甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或組氨酸、第438位由異亮氨酸變成丙氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸或組氨酸，第686位由谷氨酰胺變成甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酸，第694位由酪氨酸變成丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或組氨酸。

8、所述高效融合表達載體為水解酶及所述ssdms酶突變體融合的表達載體。

9、新穎drimane型倍半萜化合物高效生產的大腸桿菌，同時導入所述高效融合表達載體以及含氨基酸序列為seq?id?no：5-7和seq?id?no：9的表達載體的大腸桿菌細胞。

10、新穎drimane型倍半萜化合物高效生產的大腸桿菌，同時導入所述高效融合表達載體以及核酸序列為seq?id?no：8和seq?id?no：10的表達載體的大腸桿菌細胞。

11、所述的新穎drimane型倍半萜化合物高效生產的大腸桿菌在生產drimane型倍半萜化合物中的應用。

12、所述的應用，所述drimane型倍半萜化合物包括drimenol、albicanol、bicyclofarnesol、drimane-8α，11-diol中的一種或多種化合物。

13、所述的大腸桿菌生產drimane型倍半萜化合物的方法，發酵培養基為含1-5％的甘油，菌液培養至od600＝1.3～1.4時誘導，誘導時加入異丙基b-d-1-硫代吡喃半乳糖苷以及3-甲基-2-丁烯-1醇、3-甲基-3-丁烯-1醇。

14、ssdms的丙氨酸掃描突變：本發明所述ssdms為實驗室前期通過基因組挖掘發現的第一個ii型倍半萜環化酶，其來源于細菌streptomyces?showdoensis，氨基酸序列ncbi登錄號為a0a2p2gk84，編碼蛋白的氨基酸序列如序列表seq?id?no：1所示，其核苷酸序列如序列表seq?id?no：2所示。

15、本發明在實驗室ssdmsd303e-fpp-mg2+復合物蛋白質晶體結構基礎上通過pymol軟件在活性位點的半徑范圍內進行丙氨酸掃描，重點關注β結構域內的芳香殘基，它們可能通過其龐大的側鏈穩定和影響水介導的催化，并可能揭示不同的催化堿產生不同的催化產物，從而達到改變野生型ssdms催化活性的目的，具體實施方法見實施例1。

16、本發明設計構建包含突變型ssdms基因的高效表達載體均基于實驗室的水解酶和環化酶融合表達質粒petduet-ssndh-ssdms(r)，該質粒引入水解酶實現drimane型倍半萜焦磷酸產物的高效水解，編碼蛋白的氨基酸序列如序列表seq?id?no：3所示，其核苷酸序列如序列表seq?id?no：4所示。利用定點突變的方法，系統替換目標位點為丙氨酸，獲得一系列ssdms突變體并初步篩選鑒定突變體的活性和產物種類，發現具有新穎催化活性的關鍵突變位點，如f248、y505等，具體實施方法見實施例2。本發明還包括序列表seq?id?no：3所示的氨基酸序列經替換、缺失、或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，以及編碼這些氨基酸序列的核苷酸序列。

17、本發明將人工“兩步法”萜類前體高產途徑質粒及發酵優化條件應用到大腸桿菌細胞工廠中，實現ssdms突變體的異源表達和新穎drimane型倍半萜化合物的高效生產。該drimane型化合物高產體系共引入三種質粒，即包含突變型ssdms基因的高效表達載體以及實驗室萜類前體高產質粒pcdfduet-ipk-ispa-idi及prsfduet-phon(△)。質粒pcdfduet-ipk-ispa-idi核苷酸序列如序列表seq?id?no：8所示，其中ipk氨基酸序列如seq?id?no：5所示，ispa氨基酸序列如seq?id?no：6所示，idi氨基酸序列如seq?id?no：7所示；質粒prsfduet-phon(△)編碼蛋白的氨基酸序列如序列表seq?id?no：9所示，其核苷酸序列如序列表seq?id?no：10所示。運用電轉化的方法將上述質粒導入到自制的電轉感受態bl21中，挑取陽性單克隆進行培養，進而發酵生產突變產物，具體實施方法見實施例3。

18、本發明在丙氨酸掃描的基礎上，利用定點突變的方法，選擇關鍵位點進行飽和突變，即分別在目標位點引入所有20種氨基酸，獲得更多ssdms高產突變體，進一步優化酶活性和產物特異性。將其引入到drimane型化合物高產體系，對各突變株進行發酵生產，通過tlc及hplc等分析手段篩選鑒定突變體的活性和產物種類，獲得能夠催化生成新穎drimane型倍半萜化合物的優勢突變體，如f248a、f248y、y505w等，具體實施方法見實施例4、5。

19、本發明還對新穎drimane型倍半萜化合物進行發酵生產及產物確證。將包含突變型ssdms基因的高效表達載體聯合萜類前體高產質粒共同轉入大腸桿菌中開展ssdms突變體的發酵生產，發酵完成后運用tlc和hplc的方法對發酵產物進行分析。對具有新穎催化活性的突變體進行3l放大發酵，發酵產物后處理完成后通過硅膠柱層析色譜法、hplc等方法進行分離純化，最終通過h1-nmr、c13-hmr以及數據庫比對的方法進行結構鑒定和確證，獲得結構新穎的drimane型倍半萜化合物，具體實施方法見實施例5、6。

20、本發明對含新穎活性的高產突變菌株進行了產量分析。對已分離確證的化合物通過hplc建立含量相關標準曲線，按照實施例3的發酵方法對高產突變菌株進行發酵，并按照實施例5的方法對其進行后處理及hplc分析，將分析數據帶入各化合物標準曲線中，即得該高產突變菌株的產量，具體實施方法見實施例7、8。其中產量數據均由相同實驗條件下的三個平行實驗所得。

21、有益效果：本發明與現有技術相比，具有如下優點：本發明建立的ssdms定向進化策略可以有效指導其他萜類環化酶的改造，具有廣泛的適用性；發現的ssdms關鍵突變體極大地拓展了酶的催化功能，為生物合成新穎萜類化合物提供了重要的酶學資源；構建的大腸桿菌細胞工廠實現了新穎drimane型倍半萜化合物albicanol、bicyclofarnesol、drimane-8α，11-diol等化合物的高效生產，其中albicanol具有顯著的生理活性；高效生產獲得的新穎drimane型倍半萜化合物為藥物先導化合物的發現提供了更多選擇。