本發明屬于遺傳工程，涉及一種高β-紫羅蘭酮的煙草葉片及其制備方法和應用。

背景技術：

1、類胡蘿卜素是植物揮發性香氣成分形成的重要前體物，對煙葉外觀質量和香氣品質具有重要影響。煙草調制過程中類胡蘿卜素通過生物或非生物途徑進行降解產生許多香氣物質，如β-紫羅蘭酮、香葉基丙酮、芳樟醇和3-羥基-β-二氫大馬酮等。在煙草香氣成分中類胡蘿卜素裂解產物約占16種，其貢獻率高達85％。類胡蘿卜素的降解在煙草揮發性香氣物質產生中的作用一直是國內外煙草行業研究的熱點。

2、類胡蘿卜素裂解雙加氧酶4(ccd4)是一類非血紅素加氧酶，其c端存在一個保守的多肽序列，且催化活性需要二價鐵離子作為輔助因子，并與自身的四個組氨酸結合。ccd4酶定位于植物葉綠體，能夠通過裂解植物體內的環狀及鏈狀類胡蘿卜素產生多種揮發性香味物質，如：香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、假紫羅蘭酮和β-大馬酮等。通過研究不同物種ccd4基因的表達量發現，其在植物各個不同部位都有表達，其中在植物類胡蘿卜素含量高的部位表達量相對較高(如：花、葉子和果實等)。ccd4能在不同植物的9,10＝9′,10′雙鍵位置對稱切割β-胡蘿卜素產生β-紫羅蘭酮，研究ccd4基因的底物和表達方式對揭示植物果實和花朵顏色及揮發性物質產生的機制具有重要的生物學意義。

3、β-紫羅蘭酮含量是評價煙葉品質優劣的重要指標之一。煙葉β-紫羅蘭酮含量提高能夠提升煙葉品質，因此，亟需提供一種高β-紫羅蘭酮的煙草葉片及其制備方法和應用。

技術實現思路

1、針對現有技術的不足和實際需求，本發明提供一種高β-紫羅蘭酮的煙草葉片及其制備方法和應用，本發明方法獲得的煙草葉片中β-紫羅蘭酮含量比野生型煙草植株提高5倍以上，在培育高β-紫羅蘭酮含量的煙草方面具有重大的應用前景。

2、為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：

3、第一方面，本發明提供了一種高β-紫羅蘭酮的煙草葉片，所述高β-紫羅蘭酮的煙草葉片過表達基因ntccd4a，所述基因ntccd4a的核酸序列包括如seq?id?no.1所示的序列。

4、本發明獲得的轉基因煙草葉片中β-紫羅蘭酮含量比野生型煙草植株葉片提高5倍以上，在培育高β-紫羅蘭酮含量的煙草方面具有重大的應用前景。

5、seq?id?no.1：

6、ctttctacattatcactacaccctaaatctcttctttctcctaattattctcccaacacatcatcttctcttgctcttaaggtctcctccgttagaattgaagaaaggccacaaaccactactagaacaaaaccacaagaaaagccaaccccatcaccctacactcctccaaaagacactcccaaaagacaattacctacaaaatcaacaaccacaaaaaaaacagtaaagccatcatttccatcagttatcttcaatgcatttgacgatttcgtgaacactttcattgatcctcctttgaaaccttccgtcgatccaaagtatattctctctaacaactttgctccggtggatgagcttccccctactgaatgcgaggtcgtggtaggctcccttccgccttgccttgacggcgcgtacatccgaaatggccccaatcctcagtatcttccacgtggaccttaccatctttttgatggagatggaatgcttcattgcattaaaatttctcaaggcaaagctacactctgcagccgatacgtcaaaacttacaaatacataattgaacgtgaagctggttctccggttatcccaaatgtattctctggtttcaacggtctcactgcctcggcggcgcgtggtgctatcaccgcagctcgagcgattgcaggacagttcaatcccactaacggcataggcctagcaaacacaagcttagctttattcggaggcaaacttttcgctcttggtgaatctgatttaccatatgcagtaaaattagccccagatggtgatattattaccctcggccgttacgatttcgacggaaagcttttcatgagcatgacggcacatcccaaaattgacccagacactaacgaagcttttgctttccgttacggtccaatgcctccttttctaacttactttagaatcgaaccaaatggtacaaaaaccccagacgtgccaatattttctatgacacgtccgtcatttctgcatgactttgcaattactaagaaatatgcgatattctcggacatacaaataggaatgaacccacttgagttcatcaccggtggttcaccggtgagttccgactctgggaaagttccccgtcttggcgtgattccacgttacgccaaggacgagtcggaaatgaggtggttcgacgtgcccgggtttaatatcgtacatgcaattaatgcgtgggatgaagatgacggggatactatagtgatggtggcgccgaatatattgtcggtggagcatacgctggagagaatggatatgatacatgcttctgttgagaaagtgaagatagatttgaagagtgggatggtgagcagacatccagtgtcgacaaggaatcttgattttggagtcatcaatccggcttatgttgggaagaagaacaagtacgtatatgcagcgattggagaccctatgccaaagatagcaggcatagcaaaattggacgtatcagtagcagaagctgatcggcgcgaatgcatagtggcgtgccgattatttggagaaggctgctttggcggtgagccattttttgtggcaaaggatcccaacaattcggcagcggatgaggacgatggctacgttgtgtcgtatgtgcacaatgagaagacaggagagtcaaggttcttggtcatggatgcaaagtcccctaatcttgacattgtgactgctgtcaaattgcctcgtcgagtgccttacggtttccacggccttttcgtcagg。

7、第二方面，本發明提供了一種制備第一方面所述的高β-紫羅蘭酮的煙草葉片的方法，所述方法包括：構建過表達載體，農桿菌轉化，將過表達載體導入煙草葉片；所述過表達載體含有基因ntccd4a，所述基因ntccd4a的核酸序列包括如seq?id?no.1所示的序列。

8、優選地，所述構建過表達載體包括以下步驟：

9、(a)以含ntccd4a基因陽性克隆topo質粒dna為模板進行pcr擴增；

10、(b)回收目的片段產物與topo載體連接，連接后轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆并測序；

11、(c)pstⅰ/kpnⅰ雙酶切pcambia?sup1300得到載體片段，將目的片段插入pcambiasup1300，轉化大腸桿菌感受態細胞，提取質粒進行pcr檢測和酶切檢測。

12、優選地，所述pcr擴增的反應體系包括：含ntccd4a基因陽性克隆topo質粒dna、dntp、引物和高保真dna聚合酶。

13、優選地，所述pcr擴增的反應程序包括：96-98℃(例如96℃、97℃、98℃)，20-30s(例如20s、25s、30s)；96-98℃(例如96℃、97℃、98℃)，5-10s(例如5s、8s、10s)，50-55℃(例如50℃、53℃、55℃)，30-50s(例如30s、40s、50s)，70-72℃(例如70℃、71℃、72℃)，30-50s(例如30s、40s、50s)，25-30個循環(例如25個循環、28個循環、30個循環)；70-72℃(例如70℃、71℃、72℃)延伸5-10min(例如5min、8min、10min)。

14、優選地，所述農桿菌轉化包括：將農桿菌感受態細胞與重組表達載體混合，液氮速凍1-2min(例如1min、2min)，35-37℃(例如35℃、37℃)水浴3-5min(例如3min、5min)，冰浴1-2min(例如1min、2min)，向混合物中加入lb液體培養基后26-28℃(例如26℃、27℃)、200-220rpm(例如200rpm、220rpm)培養3-4h(例如3h、4h)，培養后涂布于含有卡那霉素和利福平的lb固體培養基上，26-28℃(例如26℃、27℃)倒置培養2-3天(例如2天、3天)。

15、優選地，所述將過表達載體導入煙草葉片包括以下步驟：

16、(a)挑取含有目標載體的農桿菌克隆，在含有卡那霉素和利福平的lb平板上劃線，26-28℃(例如26℃、27℃)培養2-3天(例如2天、3天)，刮取劃線菌斑接菌于含有壯觀霉素和利福平的ms培養基中，26-28℃(例如26℃、27℃)，200-220rpm(例如200rpm、220rpm)震蕩培養，菌液濃度達到od＝0.5～0.8(例如od＝0.5、od＝0.8)時進行侵染；

17、(b)70％-75％(例如70％、75％)乙醇漂洗煙草葉片1-2min(例如1min、2min)，棄乙醇，將煙草葉片與0.1-0.3％(例如0.1％、0.3％)的hgcl2溶液混合振蕩15-30min(例如15min、20min)，棄溶液，無菌水沖洗煙草葉片；

18、(c)吸去煙草葉片表面液體，切成小片，將切成小片的煙草葉片放入含目標載體的無菌ms液體培養基懸浮菌液中，靜置15-20min(例如15min、18min)，吸去煙草葉片上的多余菌液，于ms培養基中暗培養；

19、(d)暗培養后將煙草葉片轉入分化培養基中，切口接觸分化培養基，每2-3周(例如2周、3周)繼代一次，將長至3-5cm(例如3cm、5cm)的芽切下，轉入生根培養基，生根后的轉基因植株從生根培養基中取出，洗凈培養基，移植于滅菌的營養土中得到轉基因煙草；

20、(e)對轉基因煙草進行pcr驗證，鑒定轉基因陽性煙草。

21、優選地，步驟(c)中所述ms培養基中含有6-ba和naa。

22、優選地，所述ms培養基中6-ba的濃度為0.01-0.03mg/l(例如0.01mg/l、0.02mg/l、0.03mg/l)。

23、優選地，所述ms培養基中naa的濃度為1-3mg/l(例如1mg/l、2mg/l、3mg/l)。

24、優選地，所述暗培養的溫度為23℃-27℃(例如23℃、25℃、27℃)，所述暗培養的時間為2-3天(例如2天、3天)。

25、優選地，步驟(d)中所述分化培養基中含有6-ba、naa、卡那霉素和頭孢霉素。

26、優選地，所述分化培養基中6-ba的濃度為0.4-0.6mg/l(例如0.4mg/l、0.5mg/l、0.6mg/l)。

27、優選地，所述分化培養基中naa的濃度為0.05-0.2mg/l(例如0.05mg/l、0.1mg/l、0.2mg/l)。

28、優選地，所述分化培養基中卡那霉素的濃度為50-150mg/l(例如50mg/l、100mg/l、150mg/l)。

29、優選地，所述分化培養基中頭孢霉素的濃度為400-600mg/l(例如400mg/l、500mg/l、600mg/l)。

30、第三方面，本發明提供了第二方面所述的方法在培育煙草新品種中的應用。

31、與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

32、本發明方法獲得的轉基因煙草葉片中的β-紫羅蘭酮含量比野生型煙草植株葉片提高5倍以上，在培育高β-紫羅蘭酮含量的煙草方面具有重大的應用前景。