本發明屬于生物，具體涉及一種新型檢測方法，即懸浮瓊脂糖球法，用于檢測細菌向晶體礦物的趨能運動。

背景技術：

1、在不斷變化的自然環境中，很多具有運動和降解能力的細菌能夠通過趨向運動有效感知和定位代謝底物。在這些細菌中，有一類能夠進行趨能運動的細菌，它們感知并有策略地趨向可供其自身產生能量的物質。通過趨能運動，這一類細菌在環境中尋找并利用電子受體，以維持其生命活動和代謝過程，這些電子受體包括有機污染物、重金屬和金屬氧化物等。細菌趨能運動提高了污染物的生物可利用性和生物降解效率，在污染物的微生物降解過程中發揮著重要作用。

2、harris等人2012年在biochemical?society?transactions第40卷中指出，細菌能夠代謝有機物產生電子，并將這些電子跨膜運輸到胞外，完成對金屬氧化物和電極等不溶性電子受體的還原，這一過程稱為胞外電子傳遞(extracellular?electron?transport,eet)。

3、自然界中的礦物分為晶體和非晶體礦物，在微觀上，每種晶體礦物具有不同的晶型和晶面。近年來許多研究表明不同晶面的礦物具有不同的化學性質。黃曉鵬等人2018年在environmental?science:nano第5卷中指出，不同晶面的赤鐵礦對cr(vi)的吸附能力不同，{001}晶面的赤鐵礦(001-fe2o3)更易吸附六價鉻。這是由于001-fe2o3能夠提供更多的吸附位點，增強了其與cr(vi)之間的吸附作用。榮少鵬等人2018年在acs?catalysis第8卷中指出，不同晶面二氧化錳對甲醛的催化氧化能力不同，{310}晶面的二氧化錳(310-mno2)具有更高的表面能，有利于氧空位的產生從而提高了hcho氧化活性，因此310-mno2對甲醛的催化氧化能力更強。

4、希瓦氏菌mr-1(shewanellaoneidensismr-1)是一種常見的兼性厭氧菌，廣泛分布于土壤、沉積物、地表水和地下水等極大部分的中溫環境中。研究表明，mr-1能夠通過eet系統和信號轉導系統等定位不溶性電子受體所在位置，從而進行自主的定向運動。mr-1的這種趨能運動會影響吸附在固體氧化物表面污染物的轉化和環境歸趨?；谶@種特性，mr-1在環境污染的生物修復方面具有廣泛的應用前景。因此，開發一種用于檢測mr-1向晶體礦物趨能運動的方法十分必要。

5、游動平板法和毛細管法是近年來研究細菌細胞趨能運動的主要實驗手段。但是，使用游動平板法時，每組實驗都需多組游動平板進行對比和對照才可得出結論，同時，該實驗方法所需要的時間通常在24-48h以上，不能快速得到實驗結論。而毛細管法更適用于研究細菌向非晶體和弱晶體的趨能運動活性，對于大部分晶體礦物，如果將毛細管垂直放置，由于晶體礦物密度大，間隙小，在液體中分散不均勻，會堵塞毛細管；如果將毛細管水平放置，晶體礦物又會在毛細管側壁上發生沉積現象，影響趨能運動的檢測效果。

6、為了規避上述檢測方法的缺陷，開發出一種操作簡便且耗時少，適用于細菌向晶體礦物趨能運動的檢測方法，本發明創新性地提出了懸浮瓊脂糖球法。在液相體系中，細菌細胞能夠自主游向含有晶體礦物的瓊脂糖球，并將瓊脂糖球中的晶體礦物還原，生成了不同顏色的低價態金屬化合物，進而導致瓊脂糖球逐漸從邊緣開始變色。該方法能夠在同一體系中對同一種細菌向不同晶體礦物的趨能運動進行對比分析，操作方法簡便；基于對瓊脂糖球內金屬離子的鹽酸溶解提取實驗，驗證該方法可以通過測量剖面變色區域面積，有效反映生物還原晶體礦物生成的金屬離子濃度，從而準確檢測出細菌向晶體礦物趨能運動活性強弱。此外，細菌細胞在液相體系中不受固相凝膠的限制，能夠更好的展現出游動的能力，從而縮短了檢測時間。

技術實現思路

1、針對現有技術存在的問題，本發明提供一種新的檢測細菌向晶體礦物趨能運動的方法：懸浮瓊脂糖球法，通過測量瓊脂糖球剖面變色區域面積，有效反映生物還原晶體礦物生成的金屬離子濃度，從而準確檢測出細菌向晶體礦物趨能運動活性強弱。同時，該方法能夠在同一體系中對同一種細菌向不同晶體礦物的趨能運動進行對比分析，操作方法簡便，且細菌細胞在液相體系中不受固相凝膠的限制，能夠更好的展現出游動的能力，從而縮短了檢測時間。本發明直觀、操作簡便且耗時短。

2、為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

3、一種細菌向晶體礦物趨能運動的檢測方法，首先，培養具有趨能運動能力的細菌至對數生長期，得到細胞濃度為2×1011cells/ml的菌液。其次，將瓊脂糖膠體與晶體礦物懸液均勻混合，制成凝結在聚酯線上的晶體礦物瓊脂糖球。第三，基于菌液配制細菌懸液。最后，將晶體礦物瓊脂糖球懸掛于細菌懸液中，培養后取出，基于晶體礦物瓊脂糖球剖面變色區域面積，檢測細菌向晶體礦物趨能運動活性強弱。具體包括以下步驟：

4、步驟1：進行細菌培養；

5、步驟1.1，選用能夠進行趨能運動的細菌作為研究對象，于-80℃冰箱取出細菌菌保，凍融后放在已經經過紫外滅菌15min后的無菌操作臺上備用；

6、步驟1.2，將胰酪大豆胨液體培養基(tsb)溶解于30ml超純水中，獲得濃度為30g/l的tsb培養基，于121℃高壓滅菌20min，冷卻后用于細菌的活化；

7、步驟1.3，將tsb溶解于100ml超純水中，獲得濃度為30g/l的tsb培養基，于121℃高壓滅菌20min，冷卻后用于細菌的擴大培養；

8、步驟1.4，在無菌環境下從步驟1.1所得菌保中吸取100μl菌株接種到步驟1.2得到的tsb培養基中，隨后將tsb培養基置于30℃、150r/min恒溫搖床中12h，使菌種活化。所述每30ml用于細菌活化的tsb培養基中對應加入100μl菌液；

9、步驟1.5，菌種活化處理后，取菌液轉接至的步驟1.3所得tsb培養基中進行擴大培養，培養條件與步驟1.4相同，12h后細菌培養至對數增長期。所述每100ml用于細菌擴大培養的tsb培養基中對應加入1ml菌液。

10、步驟2：制備晶體礦物瓊脂糖球；

11、步驟2.1，將晶體礦物過200目篩得到晶體礦物粉末，保證礦物顆粒能夠形成穩定分布的礦物懸液。所述晶體礦物包括赤鐵礦、軟錳礦和針鐵礦等；

12、步驟2.2，室溫下，稱取過篩后的晶體礦物粉末加入滅菌后的超純水中，配制適當濃度的晶體礦物懸液。所述晶體礦物懸液濃度為3～4mm；

13、步驟2.3，配制10ml2％的瓊脂糖膠體。向燒杯中加入0.0238g?hepes，完全溶解后再加入0.0084g碳酸氫鈉、0.001g蛋白胨、0.002g酵母浸粉，并加入0.032g乳酸鈉作為電子供體，充分搖勻混合使其成為均一溶液，隨后懸空滴加4m?naoh溶液至溶液ph＝7.2，將上述溶液轉置10ml血清瓶內，加入0.2g瓊脂糖粉，使用高純氮曝氣20min將上述混合液中的氧氣除去，經121℃、20min高壓滅菌，形成2％瓊脂糖膠體，冷卻至適當溫度后備用，所述瓊脂糖溫度為50～60℃；

14、步驟2.4，在無菌條件下，將步驟2.3所得瓊脂糖膠體與步驟2.2所得晶體礦物懸液按1:1的體積比均勻混合，使礦物顆粒均勻分散在瓊脂糖膠體中，得到混合液；

15、步驟2.5，用移液槍吸取0.5ml步驟2.4所得的混合液，滴加到預先放入聚酯線的模具中，形成凝結在聚酯線上的晶體礦物瓊脂糖球。瓊脂糖球的大小和形狀可根據實驗需要進行調整，一般為半徑5mm的球形。

16、步驟3：配制細菌懸液；

17、步驟3.1，配制緩沖溶液。配制兩瓶500ml濃度為20mm的hepes緩沖溶液，使用naoh調整ph為中性，其中一瓶通入高純度n2以除去o2，兩瓶均經121℃、20min高壓滅菌后備用，定義通入高純度n2的為厭氧hepes緩沖溶液，另一瓶為好氧hepes緩沖溶液；

18、步驟3.2，離心收集步驟1.5所得菌液。將步驟1.5所得菌液搖勻后，用移液槍吸取20ml至滅菌后的離心管中，于低轉速下離心以保護細菌鞭毛，保證細菌自主運動能力良好，離心后去上清液，再用好氧hepes緩沖液洗滌，重復上述操作3次后備用。所述低轉速的轉速為5000～6000r，時間為3～5min；

19、步驟3.3，在厭氧箱中使用厭氧hepes緩沖液重懸步驟3.2所得細菌細胞，調整細胞濃度為2×1011cells/ml，得到細菌懸液，吸取50ml細菌懸液于50ml厭氧西林瓶中備用。

20、步驟4：懸掛晶體礦物瓊脂糖球于細菌懸液中；

21、步驟4.1，將步驟2.5中制成的凝結在聚酯線上的含有不同晶面晶體礦物瓊脂糖球懸掛于步驟3.3所得mr-1懸液中，并用膠塞和鋁蓋壓緊；

22、步驟4.2，將步驟4.1所得實驗體系放置于溫度為30℃的厭氧箱內培養。細菌在液相體系中會自主地趨向晶體礦物，并將其還原。因此隨著時間的變化，細菌可以將晶體礦物還原為低價態的化合物，使得晶體礦物瓊脂糖球由外而內逐漸變色。12h后取出瓊脂糖球，沿直徑將瓊脂糖球均分為兩個相同體積的半球，置于白紙上，拍攝得到一張包含兩個剖面的照片，上述操作均在厭氧箱內進行；

23、步驟4.3，將步驟4.2得到的剖面照片導入imagej?version?1.54d中，使用工具欄中“freehand?selections”工具選擇未變色區域，再使用菜單欄中“analyze”選項下的measure工具測量出未變色區域面積s1，結果顯示于area列；隨后測量出剖面面積s2，方法同上，s2-s1即可得出變色區域面積s3。s3越大，表明細菌向該晶體礦物的趨能運動活性越強。

24、本發明的有益效果：

25、(1)本發明根據瓊脂糖球剖面變色區域面積大小直觀體現細菌向晶體礦物的趨能運動活性強弱。

26、(2)本發明能夠在同一厭氧西林瓶內形成對比，操作簡便，避免了不同瓶間的培養基濃度、菌液濃度和晶體礦物濃度等細微差異；同時，細菌在液相體系中不受固相凝膠的限制，能夠更好的展現出游動的能力，因此耗時少。