本發(fā)明屬于生物，具體地說，涉及一種rna解旋酶ddx46的融合蛋白及其制備方法和應用

背景技術：

1、ddx46是一種屬于dead?box蛋白家族的rna解旋酶，主要在細胞核內發(fā)揮作用，參與mrna前體的剪接過程。ddx46通過atp依賴的方式調控rna-rna或蛋白-rna的相互作用，從而影響基因表達和細胞功能。

2、研究表明，ddx46在多種惡性腫瘤中表達水平顯著上調，如結直腸癌、食管鱗狀細胞癌、胃癌和骨肉瘤等。此外，ddx46的過表達能夠促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，并且抵抗細胞凋亡，因此它可能成為潛在的抗腫瘤藥物靶點。有證據表明，ddx46在膠質母細胞瘤、食管鱗狀細胞癌、乳腺癌、胃癌、結直腸癌、骨肉瘤、卵巢癌、皮膚鱗癌中過表達。在食管鱗狀細胞癌細胞系中，ddx46的沉默可以抑制細胞增殖并誘導凋亡。ddx46高表達的乳腺癌患者中更具有侵襲性的腫瘤表型與高級別組織學分級和淋巴結轉移顯著相關。

3、此外，ddx46還與抗病毒免疫反應有關。它通過與rna去甲基化酶alkbh5結合，清除干擾素轉錄本上的m6a修飾，從而抑制ifn-β的表達，進而影響機體的天然免疫反應，在調控抗病毒免疫應答中扮演重要角色。在細胞周期調控方面，ddx46的沉默能夠阻滯細胞周期在g1期，可能通過影響細胞周期進程來調控細胞增殖。此外，ddx46還通過pi3k/akt/mtor信號通路影響滋養(yǎng)層細胞的增殖和遷移。

4、ddx46在多種生物學過程中具有重要作用，而且可能成為潛在的抗腫瘤藥物靶點和標志物。但遺憾的是大多數研究仍處于初級階段，尚停留于體外細胞及動物實驗層面，需要進一步的探究ddx46的各項機制信息，才能將其應用于抗腫瘤治療中。

5、已有技術是采取攜帶ddx46?orf序列的表達質粒瞬時轉染hek293t細胞，過表達生產ddx46蛋白，其構建復雜，過程困難，花費大，產率低下，且并無純化蛋白生產，不適合開展高通量的抑制劑篩選。

技術實現思路

1、本發(fā)明通過e.coli表達系統(tǒng)表達重組人rna解旋酶ddx46融合蛋白trunc-ddx46，e.coli生長周期快，效率高，短時間內即可制備足量的可溶性、活性融合蛋白，適合ddx46抑制劑的高通量篩選。因此，本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足，以人皮膚成纖維細胞hsf的cdna序列為文庫模板，提供了一種易獲得的rna解旋酶ddx46基因的克隆方法、融合蛋白制備方法，所制備的融合蛋白在e.coli中具有較好的溶解性，且具備較好的atp水解酶活性和解旋酶活性。

2、一方面，本發(fā)明提供了了同時具有atp水解酶和解旋酶酶活性的trunc-ddx46融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no:1所示。

3、與天然人rna解旋酶ddx46蛋白相比，trunc-ddx46融合蛋白的n末端缺失了191個氨基酸，并且在n末端增加了融合標簽，即硫氧還原蛋白(trxa)，在c末端增加了純化標簽，即組氨酸標簽(his-tag)。

4、因此，在本發(fā)明的實施方案中，trunc-ddx46融合蛋白的n末端具有融合標簽即硫氧還原蛋白(trxa)。

5、在第二方面，本發(fā)明提供了編碼trunc-ddx46融合蛋白的核酸。

6、在本發(fā)明的實施方案中，該核酸的核苷酸序列如如seq?id?no:2所示。

7、在第三方面，本發(fā)明提供了表達載體，該表達載體含有含有編碼編碼trunc-ddx46融合蛋白的核酸。

8、在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，表達載體是是原核表達載體，原核表達載體優(yōu)選是pet32m.3c。

9、在第四方面，本發(fā)明提供了含有第三方面所述表達載體的菌株。

10、在優(yōu)選的實施方案中，上述菌株含有上述表達載體。在具體實施方案中，菌株為e.coli菌株，例如rossette?dh5α、bl21(de3)或者bl21?plyss。

11、在第五方面，本發(fā)明提供了trunc-ddx46融合蛋白的制備方法，包括如下步驟：

12、1)擴增編碼trunc-ddx46融合蛋白的核酸序列；

13、2)將核酸序列克隆到原核表達載體；

14、3)將原核表達載體轉化到e.coli菌株中；

15、4)誘導trunc-ddx46融合蛋白的表達，以及

16、5)純化trunc-ddx46融合蛋白。

17、在本發(fā)明的具體實施方案中，原核表達載體為pet32m.3c。

18、在本發(fā)明的具體實施方案中，e.coli菌株為rossette?dh5α、bl21(de3)或者bl21plyss。

19、在本發(fā)明的具體實施方案中，純化可以通過例如親和層析進行。

20、在第六方面，本發(fā)明提供了trunc-ddx46融合蛋白在以下中的用途：

21、1)制備解開寡聚核酸雙鏈結構的制劑；

22、2)rna修飾和加工，優(yōu)選mrna前體剪接；或

23、3)高通量篩選ddx46解旋酶或atp水解酶活性抑制劑。

24、與現有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果。發(fā)明通過e.coli表達系統(tǒng)表達rna解旋酶ddx46的核心功能片段，克服了天然ddx46由于分子量過大、空間結構復雜而無法通過基因工程方法獲得的問題。本發(fā)明通過基因工程技術截取天然人rna解旋酶ddx46的cds片段，并對融合蛋白進行原核表達，其生物安全性強，表達量高，純化工藝穩(wěn)定，成本低廉，有利于ddx46的規(guī)模化生產和后期的抑制劑高通量篩選。本發(fā)明相比于已有研究中采用的hek293t細胞(整合有sv40大t抗原基因的人胚腎293細胞)過表達生產ddx46蛋白的體系，克服了其構建復雜，過程困難，花費大，產率低下的缺點。本發(fā)明所采用的e.coli表達系統(tǒng)易于培養(yǎng)，生長周期更短，傳代速度快，所表達的重組融合蛋白trunc-ddx46產率更高，活性較強，更易實現規(guī)模化、擴大化的蛋白生產(見表1)。本發(fā)明制備的重組融合蛋白trunc-ddx46具有較好的生物學活性，通過體外檢測確定，其同時具備較好的atp水解酶與解旋酶酶活性，可以用于ddx46活性分析、抑制劑高通量篩選、分子間相互作用、抗體與檢測試劑盒制備等生理生化操作。

技術特征：

1.trunc-ddx46融合蛋白，其特征在于，所述trunc-ddx46融合蛋白的氨基酸序列如seqid?no:1所示。

2.根據權利要求1所述的trunc-ddx46融合蛋白，其特征在于，所述trunc-ddx46融合蛋白的n末端攜帶硫氧還蛋白a(trxa)。

3.核酸，其特征在于，所述核酸編碼權利要求1所述的trunc-ddx46融合蛋白。

4.根據權利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

5.表達載體，其特征在于，所述表達載體含有編碼權利要求3所述的核酸，優(yōu)選所述表達載體是原核表達載體，例如pet32m.3c。

6.菌株，其特征在于，所述菌株含有權利要求5所述的表達載體，優(yōu)選所述菌株為e.coli菌株，例如rossette?dh5α、bl21(de3)或者bl21?plyss。

7.trunc-ddx46融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

8.權利要求1所述的trunc-ddx46融合蛋白在以下中的用途：

技術總結
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及Trunc?DDX46融合蛋白及其制備方法。Trunc?DDX46融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。本發(fā)明的方法包括以下步驟：1)擴增編碼Trunc?DDX46融合蛋白的核酸序列；2)將核酸序列克隆到原核表達載體；3)將原核表達載體轉化到E.coli菌株中；4)誘導Trunc?DDX46融合蛋白的表達，以及5)純化Trunc?DDX46融合蛋白。Trunc?DDX46融合蛋白具有ATP水解酶活性和解旋酶活性，本發(fā)明的方法易于大規(guī)模生產，可以用于高通量篩選DDX46酶活性抑制劑，并且其蛋白表達體系簡單。

技術研發(fā)人員：馮賽,鄧園蓮,楊夢霞,張嚴冬
受保護的技術使用者：深圳開悅生命科技有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/4/28