本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，涉及一種ddx42融合蛋白及其制備方法與應用。

背景技術(shù)：

1、ddx42(deah-box?helicase42)是dead-box蛋白家族的一員，是一類atp依賴性rna解旋酶，其在rna代謝的許多過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如轉(zhuǎn)錄、翻譯起始、核糖體生物合成等。其主要作用是能夠解開rna的雙鏈結(jié)構(gòu)，通過解旋rna，促進rna分子的單鏈狀態(tài)，也為rna的后續(xù)修飾和加工提供必要條件。同時，相關(guān)研究表明，ddx42是hiv-1的抑制劑，可以抑制各種正鏈rna病毒，ddx42的耗竭會增加逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染。此外，ddx42還參與了u2snrnp的組裝，這是早期剪接體組裝的一部分。

2、從結(jié)構(gòu)上看，ddx42的3'utr非常長，幾乎延伸到第二個poly(a)位點，其gc含量較低，且含有多個連續(xù)的u序列，這些特征通常被認為是rna降解的標志。這種結(jié)構(gòu)特性可能影響其翻譯調(diào)控。ddx42在基因表達調(diào)控、剪接體組裝以及抗病毒免疫反應中發(fā)揮重要作用。rna解旋酶ddx42確定為hiv-1的內(nèi)在抗病毒抑制劑。內(nèi)源性ddx42的耗竭會增加細胞系和原代細胞中hiv-1dna的積累和感染。ddx42過表達抑制hiv-1感染，而顯性陰性突變體的表達會增加感染。此外，ddx42在抗病毒免疫中也扮演重要角色，例如它能夠抑制hiv-1的復制，而與干擾素無關(guān)。同時，ddx42還顯示出對其他病毒如zika病毒和sars-cov-2的抑制作用。

3、近年來，隨著分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，ddx42的研究也取得了顯著進展?？茖W家們通過基因敲除、rna干擾等技術(shù)，揭示了ddx42在多種細胞類型中的表達模式和功能特性。研究發(fā)現(xiàn)，ddx42在腫瘤細胞中的表達異常，可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。ddx42在神經(jīng)退行性疾病中的作用也引起了廣泛關(guān)注。研究表明，ddx42的異常表達或功能障礙可能導致神經(jīng)元的損傷和死亡，從而引發(fā)阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病。目前，針對獲得ddx42重組蛋白的研究方法較少，大多提取的都是全長型的ddx42在細胞培養(yǎng)中獲得的重組蛋白.因為ddx42蛋白的分子量高達120kd以上，載體構(gòu)建復雜，提純過程較難，花費大，產(chǎn)率低下，這些因素限制了高通量ddx42蛋白抑制劑篩選的開展。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明通過e.coli表達系統(tǒng)表達重組人rna解旋酶ddx42融合蛋白，e.coli生長周期快，效率高，短時間內(nèi)即可制備大量可溶且具有酶活性的融合蛋白，適合ddx42抑制劑的高通量篩選。因此，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，以人皮膚成纖維細胞hsf序列為文庫模板，提供一種易獲得的ddx42截短型基因的克隆方法、融合蛋白制備方法，所制備的融合蛋白在e.coli中具有較好的溶解性，且具備較好的atp水解酶活性和解旋活性。

2、一方面，本發(fā)明提供了同時具有atp水解酶和解旋酶酶活性的ddx42融合蛋白，該ddx42融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no:1所示。

3、與人rna解旋酶ddx42全長蛋白相比，ddx42融合蛋白的n末端缺失了489個氨基酸，c端缺失了802個氨基酸，同時在n末端增加了融合標簽，即硫氧還原蛋白(trxa)，在c末端增加了純化標簽，即組氨酸標簽(his-tag)。

4、因此，在本發(fā)明的實施方案中，ddx42融合蛋白的n末端具有融合標簽，即硫氧還原蛋白a(trxa)。

5、在第二方面，本發(fā)明提供了編碼ddx42融合蛋白的核酸。

6、在具體實施方案中，該核酸的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

7、在第三方面，本發(fā)明提供了表達載體，該表達載體含有第二方面的核酸。

8、在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，表達載體是細菌表達載體，例如pet.32m.3c。

9、在第四方面，本發(fā)明提供了含有權(quán)利要求第三方面所述表達載體的菌株。

10、在優(yōu)選的實施方案中，上述菌株可以為e.coli菌株，例如rosetta(de3)、bl21(de3)或bl21?plyss。

11、在第五方面，本發(fā)明提供了ddx42融合蛋白的制備方法，包括如下步驟：

12、1)擴增編碼ddx42融合蛋白的核酸序列；

13、2)將核酸序列克隆到原核表達載體；

14、3)將原核表達載體轉(zhuǎn)化到e.coli菌株中；

15、4)誘導ddx42融合蛋白的表達，以及

16、5)純化ddx42融合蛋白。

17、在本發(fā)明的具體實施方案中，原核表達載體可以為細菌表達載體，例如pet.32m.3c。

18、在本發(fā)明的具體實施方案中，e.coli菌株可以為rosetta(de3)、bl21(de3)或bl21plyss。

19、在本發(fā)明的具體實施方案中，純化可以通過例如親和層析進行。

20、在第六方面，本發(fā)明提供了ddx42融合蛋白在以下中的用途：

21、1)制備解開寡聚核酸雙鏈結(jié)構(gòu)中制劑

22、2)制備抑制hiv-1病毒的藥物

23、3)高通量篩選ddx42解旋酶或者atp水解酶活性抑制劑。

24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果。具體而言，本發(fā)明通過e.coli表達系統(tǒng)表達重組人rna解旋酶ddx42蛋白，能在短時間內(nèi)獲得大量目的蛋白，大大提高了產(chǎn)率，克服了天然ddx42的分子量大，空間結(jié)構(gòu)復雜，純化效率低的弊端。本發(fā)明通過基因工程融合蛋白技術(shù)截取天然人rna解旋酶ddx42基因的片段，并對融合蛋白進行原核生物系統(tǒng)表達，可操作性及表達量高，純化工藝穩(wěn)定，成本低廉，有利于ddx42規(guī)模化生產(chǎn)和后期的抑制劑高通量篩選。相比于已有發(fā)明采用的各種真核細胞的表達系統(tǒng)，克服了其構(gòu)建復雜，過程困難，花費大，產(chǎn)率低下的缺點，本發(fā)明所采用的e.coli表達系統(tǒng)易于培養(yǎng)生長周期更短，傳代速度快，所表達重組人rna解旋酶ddx42蛋白產(chǎn)率更高，活性較強，更易實現(xiàn)規(guī)模化、擴大化的蛋白純化(見表1)。本發(fā)明制備的重組人rna解旋酶ddx42蛋白還具有較好的生物學活性，通過體外檢測確定，其同時具備較好的atp水解酶與解旋酶活性。本發(fā)明的具有atp水解酶和解旋酶活性的ddx42融合蛋白可以用于ddx42活性分析，ddx42抑制劑的高通量篩選，分子間相互作用，抗體與檢測試劑盒制備等生理生化操作。

技術(shù)特征：

1.ddx42融合蛋白，其特征在于所述ddx42融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no:1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ddx42融合蛋白，其特征在于，所述ddx42融合蛋白的n段具有融合表達標簽即硫氧還原蛋白a(trxa)。

3.核酸，其特征在于，所述核酸編碼權(quán)利要求1所述的ddx42融合蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

5.表達載體，其特征在于，所述表達載體含有權(quán)利要求3所述核酸的載體，優(yōu)選所述表達載體為細菌表達載體，例如pet.32m.3c。

6.菌株，其特征在于，所述菌株含有權(quán)利要求5所述的表達載體，優(yōu)選所述菌株為e.coli菌株，例如rosetta(de3)、bl21(de3)或bl21?plyss。

7.ddx42融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述原核表達載體為細菌表達載體，例如pet.32m.3c。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述e.coli菌株為rosetta(de3)、bl21(de3)或bl21?plyss。

10.權(quán)利要求1所述ddx42融合蛋白在以下中的用途：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及DDX42融合蛋白及其制備方法。DDX42融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。本發(fā)明的方法包括1)擴增編碼DDX42融合蛋白的核酸序列；2)將核酸序列克隆到原核表達載體；3)將原核表達載體轉(zhuǎn)化到E.coli菌株中；4)誘導DDX42融合蛋白的表達，以及5)純化DDX42融合蛋白。本發(fā)明的DDX42融合蛋白具有ATP水解酶活性和解旋酶活性，并在抑制HIV?1和各種正鏈RNA病毒中發(fā)揮重要作用，本發(fā)明的方法易于大規(guī)模性生產(chǎn)，可以用于DDX42解旋酶的抑制劑高通量篩選，并且其表達體系簡單。

技術(shù)研發(fā)人員：鄧園蓮,馮賽,楊夢霞,張嚴冬
受保護的技術(shù)使用者：深圳開悅生命科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28