本發明涉及一種疊氮基修飾的suc2重組蛋白及其編碼基因和應用，屬于生物檢測領域。

背景技術：

1、近年來，蔗糖酶作為一種高效的水解酶，在快速將蔗糖轉化為葡萄糖方面展現出了重要的應用潛力。蔗糖酶的高效能使其成為便攜式血糖監測的理想選擇，能夠為血糖監測、生物傳感器的開發提供堅實的基礎。通過與其他生物材料的結合，蔗糖酶被廣泛應用于研發便攜式血糖儀。

2、crispr-cas系統源于細菌和古菌，作為一種天然的免疫機制，它能夠識別并切割外源dna。近年來，這一系統被改造成一種強大的檢測工具。crispr-cas系統利用特定的rna(grna)，該rna與待檢測病原體的特定核酸序列互補，從而實現對目標病原體的識別。當grna與目標dna結合后，cas蛋白被激活并形成二聚體，進而切割dna，這一過程不僅高效且具有高度特異性。通過結合各種信號放大技術(例如熒光信號或電化學信號)，可以將微量的病原體信號放大，從而進行檢測。

3、核酸蛋白偶聯物是poct應用中常見的手段。然而，傳統的核酸蛋白偶聯方法往往存在操作步驟繁雜和偶聯效率低的問題。

技術實現思路

1、發明目的：本發明所要解決的技術問題是提供了一種疊氮基修飾的suc2重組蛋白及其編碼基因和應用。

2、技術方案：為解決上述技術問題，本發明提供一種疊氮基修飾的suc2重組蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

3、suc2是來自酵母sc288的野生型蔗糖酶，是天然四聚體。因此疊氮基修飾的suc2重組蛋白也會形成四聚體，經檢測，所述疊氮基修飾的suc2重組蛋白單體由549個氨基酸組成，分子量為62.373kda，等電點為4.47。

4、本發明還提供一種編碼所述疊氮基修飾的suc2重組蛋白的基因，其核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

5、本發明還提供一種含有所述基因的表達盒、重組載體或重組工程菌。

6、本發明還提供一種促進疊氮基修飾的suc2重組蛋白的表達方法，將核苷酸序列如seq?id?no.4所示的111tag-suc2蛋白的dna克隆至原核表達載體pbad，同pevol-pazf(addgene?plasmid#31186)表達載體共同轉化大腸肝菌，以l-ara和pazf誘導表達即可。該方法采用遺傳密碼子擴展技術，借助正交的氨酰-trna合成酶(aars)/trna對，在琥珀終止密碼子位點特異性地摻入非天然疊氮基苯丙氨酸。基于疊氮基團的點擊化學反應可以顯著提高重組蛋白偶聯物的制備效率。

7、其中，具體包括以下步驟：

8、(1)將111tag-suc2蛋白的編碼基因與pbad線性載體連接，獲得重組表達載體；所述pbad線性載體的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

9、(2)用步驟(1)中所得的重組表達載體和pevol-pazf(addgene?plasmid#31186)表達載體共同轉化大腸桿菌宿主細胞，獲得重組基因工程菌；

10、(3)用步驟(2)中的重組基因工程菌作為生產菌株，加入l-ara和pazf，誘導表達。

11、本發明還提供所述疊氮基修飾的suc2重組蛋白或所述的基因在制備核酸蛋白復合物中的應用。

12、其中，所述應用基于點擊化學與dna偶聯。通過重組蛋白suc2部分引入的疊氮基團，基于點擊化學反應，與dbco-dna-biotin進行偶聯，生成核酸蛋白偶聯物。

13、本發明還提供一種核酸蛋白復合物，含有所述疊氮基修飾的suc2重組蛋白或所述的基因。

14、本發明還提供所述疊氮基修飾的suc2重組蛋白、編碼所述suc2重組蛋白的基因、含有所述基因的表達盒、重組載體或重組工程菌或所述核酸蛋白復合物在制備病原體核酸檢測試劑或試劑盒中的應用。

15、其中，所述病原體包括新型冠狀病毒或豬瘟圓環病毒。

16、本發明還提供一種病原體核酸檢測試劑或試劑盒，含有所述疊氮基修飾的suc2重組蛋白、編碼所述疊氮基修飾的suc2重組蛋白的基因、所述表達盒、重組載體或重組工程菌或所述核酸蛋白復合物。

17、本發明還基于核酸蛋白復合物建立了一種便攜性病原體核酸檢測的新方法。具體原理為：核酸蛋白復合物的biotin與sa-mb親和連接，最終生成由dna為中間連接體的suc2-mb結構。通過pcr或rt-pcr對病原體模板進行預擴增，轉化成dna/rna模板；該模板通過sgrna介導的靶標識別，激活了cas12a蛋白的反式切割活性，活化后的cas12a蛋白能夠切割suc2-mb中間連接體dna，釋放suc2水解酶作為信號被捕獲收集，用于將蔗糖轉化成葡萄糖。然而，在缺少靶標核酸的情況下，cas蛋白的核酸酶活性處于休眠狀態，不會破壞suc2-mb結構以釋放suc2水解酶產生葡萄糖，保持了suc2-mb的完整性。將crispr檢測體系中加入suc2-mb結構，經cas蛋白非特異性切割后水解蔗糖產生葡萄糖，通過便攜式個人血糖儀對體系中糖濃度進行檢測。

18、其中，包括以下步驟：核酸蛋白復合物與sa-磁珠親和結合生成suc2-mb，加入病原體核酸經預擴增后的產物、靶向crispr/cas反應液、suc2-mb以及蔗糖進行反應，反應結束后，使用血糖儀進行檢測。

19、本發明其高效結合的核酸-蛋白復合物，并結合crispr/cas系統，成功構建出以便攜式個人血糖儀為信號輸出的病原體核酸檢測方法，開發了病原體核酸快速檢測的poct平臺。

20、基于疊氮基修飾的suc2重組蛋白，本發明結合crispr-cas系統，開發了一種便攜式血糖儀病原體核酸檢測方法。所述疊氮基修飾的suc2重組蛋白的表達方法旨在克服傳統方法中偶聯蛋白操作步驟繁雜和偶聯效率低的問題。

21、有益效果：與現有技術相比，本發明具有如下顯著優點：

22、1、克服了傳統方法中偶聯蛋白操作步驟繁雜和偶聯效率低的問題，可以實現核酸與蛋白的高效結合，為高靈敏度和快速響應的檢測提供新的方案；

23、2、通過與crispr-cas系統的結合，不僅降低了該檢測方法在病原體檢測中的成本，還提高檢測方法的靈活性和適用性，推動了其在病原體核酸檢測中的應用。

技術特征：

1.一種疊氮基修飾的suc2重組蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

2.一種編碼權利要求1所述疊氮基修飾的suc2重組蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

3.一種含有權利要求2所述基因的表達盒、重組載體或重組工程菌。

4.一種促進疊氮基修飾的suc2重組蛋白的表達方法，其特征在于，將核苷酸序列如seqid?no.4所示的111tag-suc2克隆至原核表達載體pbad，同pevol-pazf表達載體共同轉化大腸肝菌，以l-ara和pazf誘導表達即可。

5.權利要求1所述疊氮基修飾的suc2重組蛋白或權利要求2所述的基因在制備核酸蛋白復合物中的應用。

6.根據權利要求5所述應用，其特征在于，所述應用基于點擊化學與dna偶聯。

7.一種核酸蛋白復合物，其特征在于，含有權利要求1所述疊氮基修飾的suc2重組蛋白或權利要求2所述的基因。

8.權利要求1所述疊氮基修飾的suc2重組蛋白、權利要求2所述的基因、權利要求3所述表達盒、重組載體或重組工程菌或權利要求7所述核酸蛋白復合物在制備病原體核酸檢測試劑或試劑盒中的應用。

9.根據權利要求8所述應用，其特征在于，所述病原體包括豬瘟圓環病毒或新型冠狀病毒。

10.一種病原體核酸檢測試劑或試劑盒，其特征在于，含有權利要求1所述疊氮基修飾的suc2重組蛋白、權利要求2所述的基因、權利要求3所述表達盒、重組載體或重組工程菌或權利要求7所述核酸蛋白復合物。

技術總結
本發明公開了一種疊氮基修飾的Suc2重組蛋白及其編碼基因和應用。所述疊氮基修飾的Suc2重組蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發明中高效結合的核酸?蛋白復合物可為高靈敏度和快速響應的檢測提供新的方案，與CRISPR?Cas系統的結合，降低該檢測方法在病原體檢測中的成本，提高其靈活性和適用性，推動其在病原體核酸檢測中的應用。

技術研發人員：劉云龍,楊若塵,魏紅麗,顧月清
受保護的技術使用者：中國藥科大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24