：本發明涉及魚類細胞培養，具體涉及一株稀有鮈鯽腸道細胞系的建立及應用。

背景技術

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背景技術：

1、稀有鮈鯽(gobiocypris?rarus)是我國特有的一種小型鯉科魚類，也是我國化學品環境管理中推薦使用的本土生物。稀有鮈鯽生物學特征研究涉及生態毒理學、魚病學和生理學等領域，其親魚性成熟時間短，繁殖季節長，產卵量大，可常年人工繁殖，因此具有成為中國特有模式魚種的潛能。建立稀有鮈鯽細胞系，開展基于稀有鮈鯽在細胞領域的生態毒理學研究將有效拓展稀有鮈鯽在毒性測試中的使用范圍，為其成為國際通用模式生物和開展魚類體外替代試驗創造條件。

2、為減少實驗魚的使用量，提高化學品毒性測試通量，人們提出基于魚細胞的急性毒性試驗預測魚類急性毒性的概念。稀有鮈鯽的細胞系開發數量較少且未被商品化，在生態毒理領域還沒有展開系統研究。

3、腸道是化學品吸收和生物轉化的主要部位，開發稀有鮈鯽腸道細胞系，建立基于稀有鮈鯽腸道細胞的化學品急性毒性篩選技術是本領域技術人員亟需解決的問題。

技術實現思路

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技術實現要素：

1、本發明的目的是提供一株稀有鮈鯽腸道細胞系的建立及應用，利用腸道開發一株稀有鮈鯽腸道細胞系，并基于該稀有鮈鯽腸道細胞系建立化學品急性毒性評估方法。

2、本發明的第一個目的是提供一株稀有鮈鯽腸道細胞系gbr-gut，保藏時間為2025年1月3日，保藏單位名稱為廣東省微生物菌種保藏中心，簡稱gdmcc，地址：廣東省廣州市越秀區先烈中路100號大院實驗大樓5樓，郵編：510070，保藏編號為gdmcc?no:65714。

3、本發明第二個目的是提供上述稀有鮈鯽腸道細胞系的構建方法，包括以下步驟：

4、(1)稀有鮈鯽腸道細胞的原代培養：取健康的稀有鮈鯽腸道組織，剪碎后消化處理，收集得到的懸浮細胞和組織碎片，接種于原代細胞培養液，進行原代培養，得到稀有鮈鯽腸道的原代培養細胞；

5、(2)稀有鮈鯽腸道細胞的傳代培養：消化處理步驟(1)的原代培養細胞，收集得到的懸浮細胞，接種于傳代細胞培養液，進行傳代培養，得到稀有鮈鯽腸道細胞系；

6、(3)細胞的凍存與復蘇：凍存細胞時，取步驟(2)的稀有鮈鯽腸道細胞系，進行消化處理，離心分離后得到的沉淀物與凍存保護液混合，梯度冷凍后，投入液氮中長期凍存；復蘇細胞時，先融化處理，再將凍存管內的細胞懸液轉移至傳代細胞培養液中，800g，離心5min得到沉淀物后，接種于傳代細胞培養液中培養。

7、優選，步驟(1)中，所述健康的稀有鮈鯽提前饑餓處理24h。

8、優選，所述原代細胞培養液為含20％v/v胎牛血清、1％v/v青霉素-鏈霉素-兩性霉素b三抗的l-15完全培養液，能夠為原代細胞的培養提供足夠的營養物質；所述傳代細胞培養液為含10％v/v胎牛血清、0～1％v/v青霉素-鏈霉素-兩性霉素b三抗的l-15完全培養液。

9、優選，所述步驟(1)具體步驟為：提前將3-5條健康稀有鮈鯽饑餓處理24h，在75％酒精中浸泡30-50s，在無菌條件下，沿側線解剖取出腸道組織，用鑷子去除表面粘液和腸道內部物質，轉移至含有終濃度為2-5％v/v青霉素-鏈霉素-兩性霉素b三抗的pbs緩沖液中；取所述腸道組織剪成1mm2的組織塊，與上述含有三抗的pbs緩沖液混合，離心分離得到沉淀物，重復2-3次與含有三抗的pbs緩沖液混合、離心分離得到沉淀物的操作，得到預處理組織塊；將預處理組織塊中加入5-12ml0.25％胰酶，消化1-2h，離心棄上清，加入原代細胞培養液，重懸后得到細胞懸液；將細胞懸液轉移至t-25細胞培養瓶，置于28℃培養，至細胞長滿培養瓶底部后，得到稀有鮈鯽腸道的原代培養細胞。

10、優選，步驟(2)具體步驟為：棄掉原代培養細胞培養后的溶液，用pbs緩沖液清洗，加入0.5-2ml0.25％胰酶消化處理，至細胞變圓后，加入10-20ml傳代細胞培養液重懸細胞，按1:2的比例進行傳代培養。

11、進一步優選，加入16ml傳代細胞培養液重懸細胞。

12、優選，步驟(3)凍存的具體步驟為：將稀有鮈鯽腸道細胞系用pbs緩沖液清洗，加入0.5-2ml0.25％胰酶消化處理，至細胞變圓后，加入5-10ml傳代細胞培養液終止消化，轉移至離心管，800g，離心5min，得到沉淀物，加入含10％dmso的細胞凍存液重懸細胞，將細胞懸液轉移至凍存管；將凍存管轉移至程序降溫盒中，將程序降溫盒置于-80℃環境4-24h后，將凍存管轉移到液氮中長期保存。

13、優選，步驟(3)復蘇的具體步驟為：將凍存的稀有鮈鯽腸道細胞從液氮中取出，迅速置于水浴中，快速晃動凍存管使管內液體融化；將凍存管內的細胞懸液轉移至5～9ml傳代細胞培養液中，800g，離心5min得到的沉淀物，加入5～10ml傳代細胞培養液重懸細胞，轉移至t-25培養瓶，置于28℃培養，12-24h后更換新鮮的培養液繼續培養，得到復蘇的稀有鮈鯽腸道細胞。

14、本發明第三個目的是提供一種基于上述稀有鮈鯽腸道細胞系的化學品急性毒性評估方法，包括以下步驟：

15、(a)接種稀有鮈鯽腸道細胞于孔板：取上述稀有鮈鯽腸道細胞系進行消化處理，獲得細胞懸液，接種于細胞培養板后，置于28℃培養24-48h，得到孔板底部長滿稀有鮈鯽腸道細胞的細胞培養板；

16、(b)將稀有鮈鯽腸道細胞暴露于受試化學品：將受試化學品溶解在遞送介質中得到暴露溶液，取步驟(a)中孔板底部長滿稀有鮈鯽腸道細胞的細胞培養板，加入暴露溶液，持續暴露24h后，得到完成暴露試驗的細胞培養板；所述遞送介質為l-15培養基；

17、(c)檢測化學品對稀有鮈鯽腸道細胞的影響：取步驟(b)完成暴露試驗的細胞培養板，先后加入工作溶液a和工作溶液b，黑暗孵育后，使用酶標儀測量，檢測細胞活力；

18、(d)數據分析：處理步驟(c)得到的原始數據，繪制濃度效應曲線，計算受試化學品的半數效應濃度。

19、優選，步驟(a)具體為：取上述稀有鮈鯽腸道細胞系，匯合度為80-95％，用pbs緩沖液清洗，加入0.25％胰酶消化處理，至細胞變圓，加入適量傳代細胞培養液，所述傳代細胞培養液為含10％胎牛血清、0～1％青霉素-鏈霉素-兩性霉素b三抗的l-15完全培養液，調整至細胞密度為4-6×105個/ml，獲得待接種細胞懸液；接種前，先加入0.5-2ml的pbs緩沖液潤洗24孔細胞培養板內的所有孔，棄去溶液后，再將待接種細胞懸液按照鋪板及給藥示意圖以500μl/孔的接種量轉移至24孔細胞培養板中，置于28℃，培養24-48h，至細胞培養板底部長滿稀有鮈鯽腸道細胞。

20、優選，步驟(b)具體為：將受試化學品溶解在dmso中得到濃縮液，按照1:200的比例將濃縮液稀釋于l-15培養基中，或者將受試化學品直接溶解于l-15培養基，得到暴露溶液；取步驟(a)中底部長滿稀有鮈鯽腸道細胞的細胞培養板，每孔輕輕加入1-2ml的pbs緩沖液，微微晃動孔板后棄去，再按照鋪板及給藥示意圖，每孔輕柔加入2ml暴露溶液后，置于28℃環境下，持續暴露24h，得到完成暴露試驗的細胞培養板。

21、優選，步驟(c)具體為：取步驟(b)完成暴露試驗的細胞培養板，棄掉暴露溶液，每孔輕輕加入1-2ml的pbs緩沖液，微微晃動孔板后棄去，在避光環境下，每孔加入400μl工作溶液a，黑暗孵育30-60min，使用530nm的激發波長和590nm的發射波長測定熒光強度；工作溶液a的熒光強度測定后，棄掉工作溶液a，在避光環境下，每孔加入400μl工作溶液b，黑暗孵育60-90min后，棄掉工作溶液b，每孔加入400μl固定液，固定時間為1-3min，棄掉固定液后，每孔加入400μl提取液，輕柔搖晃平板10-15min，最后，使用530nm的激發波長和645nm的發射波長測定熒光強度。

22、優選，所述工作溶液a包括以下體積百分比的組分:10％的刃天青溶液、90％的dpbs緩沖液。

23、優選，所述工作溶液b包括以下體積百分比的組分:1-2％的中性紅溶液、98-99％的dpbs緩沖液。

24、優選，所述固定液制備方法為:2.5g的cacl2溶于200ml超純水，加入3.38ml的37％甲醛溶液，再用超純水定容至500ml。

25、優選，所述提取液制備方法為：5ml乙酸溶于100ml超純水，加入250ml無水乙醇，再用超純水定容至500ml。

26、優選，步驟(c)中，棄掉暴露溶液、工作液a、工作液b、固定液、提取液時，采用快速倒扣細胞培養板的方式棄去液體于廢液缸。

27、優選，步驟(d)具體為：含細胞和暴露溶液孔的數值減去不含細胞的空白孔的數值得到數值j，對照組數值減去不含細胞的空白孔數值得到數值p，再用以下公式計算各個暴露濃度下的細胞活力：

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29、根據設置的受試化學品濃度和相應的細胞活力繪制受試化學品對稀有鮈鯽腸道細胞的濃度效應曲線，使用s型非線性擬合曲線計算受試化學品對稀有鮈鯽腸道細胞的半數效應濃度。

30、本發明的有益效果如下：

31、(1)本發明的稀有鮈鯽腸道細胞系可以進行長時間的傳代培養，能低溫凍存和復蘇；可應用于化學品急性毒性評估，用于魚類急性毒性的體外替代、探究化學品毒性效應等研究。

32、(2)本發明所構建的基于稀有鮈鯽腸道細胞系的化學品急性毒性評估方法，細胞鋪板均勻，方便快捷，能快速篩選出有毒受試化學品，為化學品毒性評估提供細胞毒性信息和可供選擇的體外替代方法。

33、一株稀有鮈鯽腸道細胞系gbr-gut，保藏時間為2025年1月3日，保藏單位名稱為廣東省微生物菌種保藏中心，簡稱gdmcc，地址：廣東省廣州市越秀區先烈中路100號大院實驗大樓5樓，郵編：510070，保藏編號為gdmcc?no:65714。