本發明涉及生物，具體涉及oswrky76蛋白在提高磷的利用效率和水稻產量中的應用。

背景技術：

1、磷(p)是限制植物生長和產量的大量營養元素之一。磷元素不僅構成了細胞內包括dna、rna、atp和磷脂等在內的重要大分子，而且還參與調節信號轉導，能量代謝和光合作用等重要的生理生化過程(steffen?abel,phosphate?sensing?in?root?development,current?opinion?in?plant?biology,14:303-309，2011)。

2、近年來，無機磷酸鹽饑餓脅迫對水稻葉片細胞增殖有抑制作用。磷酸鹽饑餓誘導的oscycp4s過表達可以與其他細胞周期蛋白競爭，與細胞周期蛋白依賴性激酶結合，從而通過減少細胞增殖來抑制生長(xu?l,wang?f,li?r,deng?m,fu?m,teng?h,yi?k.oscycp4scoordinate?phosphate?starvation?signaling?with?cell?cycle?progression?inrice.j?integr?plant?biol.2020jul；62(7):1017-1033.)。nigt1通過抑制生長相關調控基因的表達，包括油菜素內酯信號轉導主調控基因bzr1、細胞分裂調控基因cycb1；1和dna復制調控基因psf3，從而抑制地上部的生長(zhang?y,zhang?q,guo?m,wang?x,li?t,wu?q,li?l,yi?k,ruan?w.nigt1?represses?plant?growth?and?mitigates?phosphatestarvation?signaling?to?balance?the?growth?response?tradeoff?in?rice.j?integrplant?biol.2023aug；65(8):1874-1889)。osmyb110是一種pi依賴的負調節因子，是osphr2的直接靶點，并調節osphr2介導的水稻株高、抗倒伏和產量的抑制(wang?t,jin?y,deng?l,li?f,wang?z,zhu?y,wu?y,qu?h,zhang?s,liu?y,mei?h,luo?l,yan?m,gu?m,xu?g.thetranscription?factor?myb110?regulates?plant?height,lodging?resistance,andgrain?yield?in?rice.plant?cell.2024jan?30；36(2):298-323.)。雖然有如此多的基因參與水稻葉片大小的調控，但對其相關作用關系知之甚少，因此還需要進一步深入研究水稻葉片生長調控的遺傳網絡。

3、盡管有復雜的磷酸鹽吸收、儲存和同化機制，但磷酸鹽濃度在時間和空間上的波動要求農民向土壤提供磷肥，以確保作物的最佳產量。因此，研究磷饑餓抑制植物地上部分生長的機理對培育磷高效利用作物非常重要。

技術實現思路

1、本發明的目的是提高植物磷的利用效率和/或產量。

2、本發明首先保護蛋白質oswrky76的應用，可為s1)-s8)中的至少一種：

3、s1)調控植物葉片長度；

4、s2)調控植物地上部分生物量；

5、s3)調控植物磷的利用效率；

6、s4)調控植物產量；

7、s5)培育葉片長度改變的轉基因植物；

8、s6)培育地上部分生物量改變的轉基因植物；

9、s7)培育磷的利用效率改變的轉基因植物；

10、s8)培育產量改變的轉基因植物；

11、上述應用中，所述蛋白質oswrky76可為a1)或a2)或a3)：

12、a1)氨基酸序列是seq?id?no：3所示的蛋白質；

13、a2)在seq?id?no：3所示的蛋白質的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質；

14、a3)將a1)或a2)所示的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與植物葉片長度和/或地上部分生物量相關的蛋白質。

15、其中，seq?id?no：3由327個氨基酸殘基組成。

16、為了使a1)中的蛋白質便于純化，可在seq?id?no：3所示的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。

17、表1.標簽的序列

18、 標簽 殘基 序列 poly-arg 5-6(通常為5個) rrrrr flag 8 dykddddk strep-tagii 8 wshpqfek c-myc 10 eqkliseedl

19、上述a3)中的蛋白質，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

20、上述a3)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。

21、上述a3)中的蛋白質的編碼基因可通過將seq?id?no：1或seq?id?no：2所示的dna序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。

22、本發明還保護編碼上述任一所述蛋白質oswrky76的核酸分子的應用，可為s1)-s8)中的至少一種：

23、s1)調控植物葉片長度；

24、s2)調控植物地上部分生物量；

25、s3)調控植物磷的利用效率；

26、s4)調控植物產量；

27、s5)培育葉片長度改變的轉基因植物；

28、s6)培育地上部分生物量改變的轉基因植物；

29、s7)培育磷的利用效率改變的轉基因植物；

30、s8)培育產量改變的轉基因植物；

31、上述應用中，所述編碼蛋白質oswrky76的核酸分子可為如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：

32、b1)編碼區是seq?id?no：2所示的dna分子；

33、b2)核苷酸序列是seq?id?no：2或seq?id?no：1所示的dna分子；

34、b3)與b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質oswrky76的dna分子；

35、b4)在嚴格條件下與b1)或b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質oswrky76的dna分子。

36、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

37、其中，seq?id?no：1由1782個核苷酸組成，seq?id?no：2由984個核苷酸組成，seqid?no：1或seq?id?no：2所示的核苷酸編碼seq?id?no：3所示的氨基酸序列。

38、本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發明的編碼所述蛋白質oswrky76的核苷酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有與本發明分離得到的所述蛋白質oswrky76的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼所述蛋白質oswrky76，均是衍生于本發明的核苷酸序列并且等同于本發明的序列。

39、這里使用的術語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發明的編碼seq?id?no：1所示的氨基酸序列組成的蛋白質oswrky76的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。

40、上述任一所述的應用中，所述調控植物葉片長度可為增加植物葉片長度或減少植物葉片長度。

41、上述任一所述的應用中，所述調控植物地上部分生物量可為提高植物地上部分生物量或降低植物地上部分生物量。

42、上述任一所述的應用中，所述調控植物磷的利用效率可為提高植物磷的利用效率或降低植物磷的利用效率；

43、上述任一所述的應用中，所述調控植物產量可為提高植物產量或降低植物產量。

44、本發明還保護一種培育轉基因植物甲的方法，可包括如下步驟：提高出發植物中上述任一所述蛋白質oswrky76的表達量和/或活性，得到轉基因植物甲；與出發植物相比，轉基因植物甲的磷的利用效率提高、葉片長度增加、地上部分生物量提高和/或產量提高。

45、上述方法中，所述“提高出發植物中上述任一所述蛋白質oswrky76的表達量和/或活性”可通過轉基因、多拷貝、改變啟動子、調控因子等本領域熟知的方法，達到提高出發植物中上述任一所述蛋白質oswrky76的表達量和/或活性的效果。

46、上述方法中，所述“提高出發植物中上述任一所述蛋白質oswrky76的表達量和/或活性”具體可通過向出發植物中導入編碼上述任一所述蛋白質oswrky76的核酸分子實現。

47、上述方法中，所述“向出發植物中導入編碼上述任一所述蛋白質oswrky76的核酸分子”可通過向出發植物中導入重組載體實現；所述重組載體可為向表達載體插入編碼上述任一所述蛋白質oswrky76的核酸分子，得到的重組質粒。

48、所述重組載體具體可為重組質粒pcambia1300-poswrky76:gfp:oswrky76-rbcs。所述重組質粒pcambia1300-poswrky76:gfp:oswrky76-rbcs可為將pcambia1300-rbcs載體的限制性內切酶kpni和bamhi之間的dna小片段替換為核苷酸序列如seq?id?no:5所示的目的dna片段，得到的重組質粒。

49、所述轉基因植物具體可為實施例2提及的co-6和co-15。此時出發植物為水稻，具體為水稻品種石狩白毛。

50、本發明還保護一種培育轉基因植物乙的方法，可包括如下步驟：降低出發植物中上述任一所述蛋白質oswrky76的表達量和/或活性，得到轉基因植物乙；與出發植物相比，轉基因植物乙的磷的利用效率降低、葉片長度減少、地上部分生物量降低和/或產量降低。

51、上述方法中，所述降低出發植物中上述任一所述蛋白質oswrky76的表達量和/或活性可通過dna插入、rna干擾、同源重組、基因定點編輯等本領域熟知的方法，達到降低出發植物中上述任一所述蛋白質oswrky76的表達量和/或活性的目的。

52、具體的，所述降低出發植物中上述任一所述蛋白質oswrky76的表達量和/或活性可通過突變出發植物中上述任一所述蛋白質oswrky76的編碼基因來實現。

53、上述任一所述蛋白質oswrky76的編碼基因可為如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：

54、b1)編碼區是seq?id?no：2所示的dna分子；

55、b2)核苷酸序列是seq?id?no：2或seq?id?no：1所示的dna分子；

56、b3)與b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質oswrky76的dna分子；

57、b4)在嚴格條件下與b1)或b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質oswrky76的dna分子。

58、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

59、其中，seq?id?no：1由1782個核苷酸組成，seq?id?no：2由984個核苷酸組成，seqid?no：1或seq?id?no：2所示的核苷酸編碼seq?id?no：3所示的氨基酸序列。

60、本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發明的編碼所述蛋白質oswrky76的核苷酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有與本發明分離得到的所述蛋白質oswrky76的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼所述蛋白質oswrky76，均是衍生于本發明的核苷酸序列并且等同于本發明的序列。

61、這里使用的術語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發明的編碼seq?id?no：1所示的氨基酸序列組成的蛋白質oswrky76的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。

62、上述方法中，所述突變出發植物中所述蛋白質oswrky76的編碼基因可為將seqidno：2所示的oswrky76基因突變為oswrky76/+1bp。所述oswrky76/+1bp是seq?id?no：2自5’末端起第17位和第18位之間插入1個核苷酸，保持seq?id?no：2的其他核苷酸序列不變得到的dna分子。優選的，所述插入1個核苷酸可為核苷酸a或核苷酸t。

63、上述方法中，所述突變出發植物中所述蛋白質oswrky76的編碼基因是通過將crispr/cas9系統導入出發植物實現的。所述crispr/cas9系統可包括重組表達載體；所述重組表達載體含有表達靶向所述蛋白質oswrky76的編碼基因的grna的dna分子。

64、上述方法中，所述grna的靶標序列可為seq?id?no：2自5’末端起第1-20位所示。

65、本發明還保護突變出發植物中上述任一所述蛋白質oswrky76的編碼基因的物質的應用，可為s1)-s8)中的至少一種：

66、s1)調控植物葉片長度；

67、s2)調控植物地上部分生物量；

68、s3)調控植物磷的利用效率；

69、s4)調控植物產量；

70、s5)培育葉片長度改變的轉基因植物；

71、s6)培育地上部分生物量改變的轉基因植物；

72、s7)培育磷的利用效率改變的轉基因植物；

73、s8)培育產量改變的轉基因植物。

74、上述應用中，所述突變出發植物中上述任一所述蛋白質oswrky76的編碼基因可為將seq?id?no：2所示的oswrky76基因突變為oswrky76/+1bp。所述oswrky76/+1bp是seq?idno：2自5’末端起第17位和第18位之間插入1個核苷酸，保持seq?id?no：2的其他核苷酸序列不變得到的dna分子。優選的，所述插入1個核苷酸可為核苷酸a或核苷酸t。

75、上述應用中，所述突變出發植物中上述任一所述蛋白質oswrky76的編碼基因的物質可為crispr/cas9系統。所述crispr/cas9系統可包括重組表達載體；所述重組表達載體含有表達靶向上述任一所述蛋白質oswrky76的編碼基因的grna的dna分子。優選的，所述grna的靶標序列可為seq?id?no：2自5’末端起第1-20位所示。

76、上述任一所述葉片可為成熟水稻植株葉片、劍葉、l3葉片、l4葉片、l5葉片和l6葉片中的至少一種。

77、所述l3葉片可為植物根部從下往上數的第三片葉。

78、所述l4葉片可為植物根部從下往上數的第四片葉。

79、所述l5葉片可為植物根部從下往上數的第五片葉。

80、所述l6葉片可為植物根部從下往上數的第六片葉。

81、上述任一所述植物可為如下c1)至c5)中的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品種石狩白毛。

82、上述任一所述地上部分生物量可為地上部分鮮重。

83、上述任一所述產量可為單株產量。

84、實驗證明，采用含有oswrky76基因敲除載體(即重組質粒pyl?crispr/cas9-oswrky76)的重組農桿菌轉化水稻品種石狩白毛，能夠對oswrky76基因進行編輯，oswrky76基因通過crispr/cas9核酸內切酶編輯之后，可造成oswrky76基因突變，當兩條同源染色體的oswrky76基因均發生突變時，可以導致蛋白質oswrky76活性喪失；蛋白質oswrky76活性喪失造成轉基因水稻的葉片長度減少、地上部分生物量降低、磷的利用效率降低和產量降低。同時提高水稻品種石狩白毛中蛋白質oswrky76的表達量可以提高磷的利用效率、增加水稻葉片長度、提高地上部分生物量和提高產量。由此可見，蛋白質oswrky76可以調控磷的利用效率、水稻葉片長度、地上部分生物量和產量。本發明具有重要的應用價值。