本發明涉及生物，具體涉及一種用于馬鈴薯二倍體鑒定的ssr標記檢測引物及用途。

背景技術：

1、馬鈴薯是茄科(solanacea)茄屬(solanum)中具有可食用塊莖的部分物種的總稱，原產南美洲安第斯山系。目前，已發現馬鈴薯有235個種，其中有包括普通栽培種和原始栽培種在內的7個栽培種，228個野生種。這些物種的倍性也比較復雜，有二倍體(如s.phureja)、三倍體(如s.juzepczukii)、四倍體(如s.tuberosum)和五倍體(如s.curtilobum)等，且多為二倍體。各不同倍性材料間雜交困難，為開發利用豐富的二倍體資源，就需要將四倍體普通栽培種s.tuberosum降倍為二倍體。

2、目前科學研究中常用的馬鈴薯倍性鑒定方法有(1)植株形態鑒定：與倍性較低材料相比，高倍材料的葉片較厚、莖稈較粗、花和果實均較大等。但目前對控制各性狀基因的作用并不十分清楚，例外情況很多，該方法只能作為倍性鑒定的輔助手段。(2)氣孔保衛細胞葉綠體計數：一個物種的氣孔保衛細胞中葉綠體的數量基本恒定，其數量通常也隨著倍性的提高而增加，因此通過氣孔保衛細胞的葉綠體數量可大致判斷物種的倍性。(3)流式細胞術：利用流式細胞儀可以直接測定細胞的dna含量，從而鑒定植株的倍性。但目前這種方法無法判斷生物中的非整倍體。(4)染色體計數：生物的倍性和細胞內染色體數目有關，選用細胞分裂旺盛組織處于分裂期中后期的細胞來進行染色體計數是最直觀、最準確的一種倍性鑒定的方法。但這種方法工作效率低，對人員的實驗技能要求較高。(5)分子標記鑒定：通常所說的分子標記是基因組中的一段特殊的dna序列，通過檢測這些dna序列的差異可以作為輔助證據，判斷植物的基因(組)來源及倍性。(6)全基因組測序：對實驗材料進行全基因組測序，拼接組裝，依據組裝的染色體序列進行倍性判斷，但價格昂貴，對操作人員的技能要求非常高。

3、鄭英轉等人在馬鈴薯“合作88”降倍群體中以ssr標記鑒定馬鈴薯三、四倍體和二倍體進行過研究。該研究以7對ssr引物對c88降倍群體中的二、三、四倍體進行了親緣關系分析。依據ssr檢測結果，這7對引物對降倍群體的倍性誤檢率為12.0％。而這7對引物用于檢測“麗薯6號”的降倍群體，發現結果混亂無法用于該群體親本及降倍群體的倍性檢測。因此，有必要找到適應于“麗薯6號”降倍群體的ssr標記引物，用于快速準確地鑒定馬鈴薯倍性。

技術實現思路

1、為了克服上述技術缺陷的不足，本發明提供一種用于馬鈴薯二倍體鑒定的ssr標記檢測引物及用途，可以用于快速鑒定高產馬鈴薯品種“麗薯6號”及其衍生材料的倍性。

2、為實現上述目的，本發明通過以下方案實現予以實現：

3、利用在illumina?xplus測序平臺和pacbio測序平臺對母本“麗薯6號”進行基因組測序，用soapdenovo和hifiasm對二代和三代測序結果進行全基因組序列拼接組裝。對組裝好的“麗薯6號”基因組進行ssr掃描分析，將對得到的ssr片段兩翼各延伸100-200bp進行引物設計得到相應的檢測引物。在“麗薯6號”降倍群體中以檢測引物進行pcr擴增，并對擴增產物進行電泳檢測，根據電泳結果進行篩選，發明人確定了6對可用于組合區分該群體倍性的引物(篩選流程見圖1)，可用于快速、準確的鑒定分析“麗薯6號”降倍群體的倍性及基因組純度。

4、因此，第一方面本發明提供一種用于馬鈴薯二倍體鑒定的ssr標記檢測引物，包括如下所示的引物對：

5、引物對a1：包括核苷酸序列分別如seq?id?no：1和seq?id?no：2所示的正向引物和反向引物；

6、引物對a2：包括核苷酸序列分別如seq?id?no：3和seq?id?no：4所示的正向引物和反向引物；

7、引物對a3：包括核苷酸序列分別如seq?id?no：5和seq?id?no：6所示的正向引物和反向引物；

8、引物對b1：包括核苷酸序列分別如seq?id?no：7和seq?id?no：8所示的正向引物和反向引物；

9、引物對g3：包括核苷酸序列分別如seq?id?no：9和seq?id?no：10所示的正向引物和反向引物；

10、引物對g4：包括核苷酸序列分別如seq?id?no：11和seq?id?no：12所示的正向引物和反向引物。

11、本發明利用這6對引物應用于馬鈴薯四倍體品種“麗薯6號”的親本及降倍群體的倍性檢測，準確率高達97.8％。

12、進一步地，引物的核苷酸序列為(a)、(b)或(c)，達到相同的檢測目的；

13、(a)如seq?id?no.1-seq?id?no.12所示的核苷酸序列；

14、(b)嚴格條件下與seq?id?no.1-seq?id?no.12所示的核苷酸序列雜交且編碼的核苷酸序列；

15、(c)與seq?id?no.1-seq?id?no.12所示的核苷酸序列具有80％以上同源性且編碼的核苷酸序列。

16、一些具體的實施例中，本發明提供了ssr標記檢測引物對組的核苷酸序列與seqid?no.1-seq?id?no.12所示序列具有80％同一性；優選的具有85％同一性，更優選的具有90％同一性，更優選的具有95％同一性，最優選的，具有99％同一性。

17、示例性地，在本文中所述“嚴格條件”是指探針將與其靶序列雜交至可探測程度超過與其它序列雜交(如至少2倍于背景)的條件。嚴格條件具有序列依賴性，且因環境的不同而不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可以鑒定與探針100％互補的靶序列。可選擇地，可以調節嚴格條件以允許一些序列錯配，使得探測到較低程度的相似性。這些在嚴格條件下雜交的核苷酸序列可用于，例如，表達seq?id?no.1的變體蛋白質或可作為引物、探針、外源供體序列、向導rna、反義rna、shrna和sirna。

18、第二方面，本發明提供用于馬鈴薯二倍體鑒定的試劑盒，包括上述的引物對組。

19、第三方面，本發明提供ssr標記檢測引物對組在馬鈴薯遠緣雜交后代的倍性鑒定中的用途。

20、進一步地，所述馬鈴薯為“麗薯6號”。

21、進一步地，確定待測樣本中是否包括(a)-(n)所示的dna片段；

22、(a)如seq?id?no：13所示的核苷酸序列；

23、(b)如seq?id?no：14所示的核苷酸序列；

24、(c)如seq?id?no：15所示的核苷酸序列；

25、(d)如seq?id?no：16所示的核苷酸序列；

26、(e)如seq?id?no：17所示的核苷酸序列；

27、(f)如seq?id?no：18所示的核苷酸序列；

28、(g)如seq?id?no：19所示的核苷酸序列；

29、(h)如seq?id?no：20所示的核苷酸序列；

30、(i)如seq?id?no：21所示的核苷酸序列；

31、(j)如seq?id?no：22所示的核苷酸序列；

32、(k)如seq?id?no：23所示的核苷酸序列；

33、(l)如seq?id?no：24所示的核苷酸序列；

34、(m)如seq?id?no：25所示的核苷酸序列；

35、(n)如seq?id?no：26所示的核苷酸序列。

36、一些具體的實施例中，將6對引物(其核苷酸序列如seq?id?no.1-seq?id?no.12所示)在母本中共可擴增出14條dna片段(其核苷酸序列如seq?id?no.13-seq?id?no.26所示)，根據這些dna片段的有無，可以用于鑒定遠緣雜交后代的倍性。

37、第三方面，本發明提供ssr標記檢測引物對組在馬鈴薯遠緣雜交后代基因組純度鑒定中的用途。

38、進一步地，所述馬鈴薯為“麗薯6號”。

39、進一步地，所述用途包括用于核酸雜交檢測、分子標記、制備基因芯片、制備分子探針、制備檢測試劑盒。

40、進一步地，確定待測樣本中是否包括(a)-(i)所示的dna片段；

41、(a)如seq?id?no：27所示的核苷酸序列；

42、(b)如seq?id?no：28所示的核苷酸序列；

43、(c)如seq?id?no：29所示的核苷酸序列；

44、(d)如seq?id?no：30所示的核苷酸序列；

45、(e)如seq?id?no：31所示的核苷酸序列；

46、(f)如seq?id?no：32所示的核苷酸序列；

47、(g)如seq?id?no：33所示的核苷酸序列；

48、(h)如seq?id?no：34所示的核苷酸序列；

49、(i)如seq?id?no：35所示的核苷酸序列。

50、一些具體的實施例中，將6對引物(其核苷酸序列如seq?id?no.1-seq?id?no.12所示)在父本ivp101中共可擴增出9條dna片段(其核苷酸序列如seq?id?no.29-seq?id?no.36所示)，根據這些dna片段的有無，可以推斷倍材料中是否有父本基因的滲入，從而用于鑒定遠緣雜交后代基因組純度。

51、進一步地，所述馬鈴薯為“麗薯6號”。

52、進一步地，所述用途包括用于核酸雜交檢測、分子標記、制備基因芯片、制備分子探針、制備檢測試劑盒。

53、與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

54、(1)以6對ssr標記引物的擴增結果檢測判斷降倍群體的倍性，與基因組測序、流式細胞術向比較，不需要特殊專用的儀器設備，檢測成本也更低；

55、(2)與胚斑標記、植株形態觀察、生理生化指標測定等方法相比，檢測結果更客觀、更準確、且重復性好。