本發明涉及分子鑒定，具體涉及一種基于indel標記的辣椒‘thi-p×tp023-p’分子身份證構建及應用。

背景技術：

1、辣椒栽培歷史悠久。辣椒不僅營養豐富，具有非常高的食用價值，還具備重要的藥用價值，可謂藥食同源，深受人們喜愛。辣椒年播種面積達213.33萬hm2。

2、近年來，辣椒產品市場更加細分化。辣椒品種類型也更加豐富。加工產品除了辣椒醬、剁椒醬、辣椒粉等傳統產品外，更多的新產品也不斷涌現。這些各種各樣的產品都需要專用的辣椒品種，才能保證產品質量。

3、辣椒品種越來越多，同質化現象就會越來越嚴重，許多品種是不易區別的。傳統的辣椒品種鑒定或雜交種子純度鑒定方法有形態學鑒定、農業性狀鑒定、細胞學鑒定。但是，這些方法存在工作量大、周期長、表型觀察不穩定等很多弊端，而且這些鑒定方法對鑒定人員的要求比較高，需要鑒定人員十分熟悉品種及其親本之間的差異，很難剔除環境以及人為因素的影響。因此，很有必要建立基于基因型的快速鑒定方法。

4、分子標記鑒定是直接深入到生物的遺傳本質，是一種能夠反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性dna片段。這些標記可以是基因本身，也可以是基因間的非編碼序列。插入缺失長度多態性(insertion-deletion?length?polymorphism,indel)標記是在等位基因位點上一定數量的核苷酸插入或缺失而產生的長度多態性變異。indel標記數量豐富、遺傳穩定，已經被廣泛應用于dna遺傳圖譜構建、遺傳連鎖圖譜構建、基因定位和純度鑒定等工作中。

5、辣椒品種‘thi-p×tp023-p’是由湖北省農業科學院經濟作物研究所培育的優質加工辣椒雜交品種，屬中熟品種，植株生長勢較強，坐果力較強，果實長羊角形，椒條順直，青果深綠色，紅果鮮紅，果面較光滑，二心室，肉質脆，味辣，果縱徑22.5cm左右，橫徑1.4cm左右，單果重18.7g左右，畝產量3000kg以上。

6、‘thi-p×tp023-p’是一代雜交種，是母本thi-p花進行去雄后再授以父本tp023-p花粉雜交獲得，但是如果母本thi-p花去雄不徹底或者漏掉去雄，會產生假的雜種，嚴重影響‘thi-p×tp023-p’制種的純度。

7、迄今為止，尚未有適于辣椒品種‘thi-p×tp023-p’、thi-p、tp023-p的分子標記及其鑒定方法，開發適用于辣椒品種‘thi-p×tp023-p’、thi-p、tp023-p的分子鑒定標記，有利于確保辣椒品種真實性，保障辣椒制種純度，加強市場監管和強化知識產權保護等。

技術實現思路

1、本發明提供了基于indel標記的辣椒‘thi-p×tp023-p’分子身份證構建及應用，有效地解決了現有辣椒品種‘thi-p×tp023-p’品種、thi-p、tp023-p真實性或‘thi-p×tp023-p’種子純度檢測工作存在的問題。

2、為實現上述目的，本發明采用以下技術方案實現：

3、本發明的第一個目的是提供一種用于構建辣椒‘thi-p×tp023-p’分子身份證的分子標記引物組，包括如下12對indel標記引物組，分別為：

4、分子標記indel-chr01-1的引物，上游引物核苷酸序列如seq?id?no.1所示，下游引物核苷酸序列如seq?id?no.2所示；

5、分子標記indel-pepchr02-2的引物，上游引物核苷酸序列如seq?id?no.3所示，下游引物核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

6、分子標記indel-pepchr03-1的引物，上游引物核苷酸序列如seq?id?no.5所示，下游引物核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

7、分子標記indel-pepchr04-3的引物，上游引物核苷酸序列如seq?id?no.7所示，下游引物核苷酸序列如seq?id?no.8所示；

8、分子標記indel-pchr05-6的引物，上游引物核苷酸序列如seq?id?no.9所示，下游引物核苷酸序列如seq?id?no.10所示；

9、分子標記indel-chr06-4的引物，上游引物核苷酸序列如seq?id?no.11所示，下游引物核苷酸序列如seq?id?no.12所示；

10、分子標記indel-pchr07-1的引物，上游引物核苷酸序列如seq?id?no.13所示，下游引物核苷酸序列如seq?id?no.14所示；

11、分子標記indel-chr08-2的引物，上游引物核苷酸序列如seq?id?no.15所示，下游引物核苷酸序列如seq?id?no.16所示；

12、分子標記indel-pepchr09-7的引物，上游引物核苷酸序列如seq?id?no.17所示，下游引物核苷酸序列如seq?id?no.18所示；

13、分子標記indel-pepchr10-6的引物，上游引物核苷酸序列如seq?id?no.19所示，下游引物核苷酸序列如seq?id?no.20所示；

14、分子標記indel-pchr11-10的引物，上游引物核苷酸序列如seq?id?no.21所示，下游引物核苷酸序列如seq?id?no.22所示；

15、分子標記indel-pchr12-4的引物，上游引物核苷酸序列如seq?id?no.23所示，下游引物核苷酸序列如seq?id?no.24所示。

16、本發明的第二個目的是提供所述的基于indel標記的辣椒‘thi-p×tp023-p’分子身份證構建在辣椒‘thi-p×tp023-p’種子純度鑒定中的應用。

17、本發明的第三個目的是提供所述的基于indel標記的辣椒‘thi-p×tp023-p’分子身份證構建在辣椒‘thi-p×tp023-p’品種、thi-p和tp023-p真偽性鑒定中的應用。

18、本發明的第四個目的是提供一種鑒定辣椒‘thi-p×tp023-p’品種雜種純度以及辣椒‘thi-p×tp023-p’品種、thi-p和tp023-p真偽性的方法，包括利用所述的indel分子標記引物組對所述辣椒品種的待測樣本進行pcr擴增的步驟。

19、作為上述方案的優選，所述pcr擴增的程序為：94℃預變性2min；94℃變性15s，52℃退火15s，72℃延伸35s，35次循環；最后72℃繼續延伸10min。

20、作為上述方案的優選，所述pcr擴增的體系為：2×magic?green?taq?supermix(包含特殊修飾的taq?dnapolymerase、dntp以及優化的緩沖體系)5μl，10μm正向引物與反向引物各1.0μl，gdna模板10ng-100ng，加ddh2o至10μl。

21、作為上述方案的優選，分子標記indel-chr01-1在‘thi-p×tp023-p’母本thi-p、‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p中各擴增出1條特征帶，條帶大小分別為150bp和178bp，‘thi-p×tp023-p’品種同時具有‘thi-p×tp023-p’母本thi-p和‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p的兩個特征帶；分子標記indel-pepchr02-2在‘thi-p×tp023-p’母本thi-p、‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p中各擴增出1條特征帶，條帶大小分別為為150bp和196bp，‘thi-p×tp023-p’品種同時具有‘thi-p×tp023-p’母本thi-p和‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p的兩個特征帶；分子標記indel-pepchr03-1在‘thi-p×tp023-p’母本thi-p、‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p中各擴增出1條特征帶，條帶大小分別為119bp和147bp，‘thi-p×tp023-p’品種同時具有‘thi-p×tp023-p’母本thi-p和‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p的兩個特征帶；分子標記indel-pepchr04-3在‘thi-p×tp023-p’母本thi-p、‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p中各擴增出1條特征帶，條帶大小分別為116bp和147bp，‘thi-p×tp023-p’品種同時具有‘thi-p×tp023-p’母本thi-p和‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p的兩個特征帶；分子標記indel-pchr05-6在‘thi-p×tp023-p’母本thi-p、‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p中各擴增出1條特征帶，條帶大小分別為191bp和268bp，‘thi-p×tp023-p’品種同時具有‘thi-p×tp023-p’母本thi-p和‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p的兩個特征帶；分子標記indel-chr06-4在‘thi-p×tp023-p’母本thi-p、‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p中各擴增出1條特征帶，條帶大小分別為177bp和150bp，‘thi-p×tp023-p’品種同時具有‘thi-p×tp023-p’母本thi-p和‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p的兩個特征帶；分子標記indel-pchr07-1在‘thi-p×tp023-p’母本thi-p、‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p中各擴增出1條特征帶，條帶大小分別為195bp和163bp，‘thi-p×tp023-p’品種同時具有‘thi-p×tp023-p’母本thi-p和‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p的兩個特征帶；分子標記indel-chr08-2在‘thi-p×tp023-p’母本thi-p、‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p中各擴增出1條特征帶，條帶大小分別為187bp和167bp，‘thi-p×tp023-p’品種同時具有‘thi-p×tp023-p’母本thi-p和‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p的兩個特征帶；分子標記indel-pepchr09-7在‘thi-p×tp023-p’母本thi-p、‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p中各擴增出1條特征帶，條帶大小分別為158bp和182bp，‘thi-p×tp023-p’品種同時具有‘thi-p×tp023-p’母本thi-p和‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p的兩個特征帶；分子標記indel-pepchr10-6在‘thi-p×tp023-p’母本thi-p、‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p中各擴增出1條特征帶，條帶大小分別為152bp和186bp，‘thi-p×tp023-p’品種同時具有‘thi-p×tp023-p’母本thi-p和‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p的兩個特征帶；分子標記indel-pchr11-10在‘thi-p×tp023-p’母本thi-p、‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p中各擴增出1條特征帶，條帶大小分別為136bp和235bp，‘thi-p×tp023-p’品種同時具有‘thi-p×tp023-p’母本thi-p和‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p的兩個特征帶；分子標記indel-pchr12-4在‘thi-p×tp023-p’母本thi-p、‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p中各擴增出1條特征帶，條帶大小分別為196bp和144bp，‘thi-p×tp023-p’品種同時具有‘thi-p×tp023-p’母本thi-p和‘thi-p×tp023-p’父本tp023-p的兩個特征帶。

22、作為上述方案的優選，種子純度＝檢測到的12種擴增產物的帶型均同時具有辣椒雜交種‘thi-p×tp023-p’母本thi-p和父本tp023-p的帶型的個數/檢測種子總數×100％。

23、由于具有上述結構，本發明的有益效果在于：

24、1.本發明利用辣椒品種‘thi-p×tp023-p’的母本thi-p和父本tp023-p重測序數據在全基因組范圍內篩選差異indel位點并設計特異性引物，準確性高、結果穩定可靠；

25、2.本發明基于pcr擴增反應，利用12個位點上的indel分子標記，在短時間內能快速精確完成辣椒品種‘thi-p×tp023-p’真實性鑒定或雜交種子純度鑒定，方法簡便快捷、檢測周期短、節省成本，具有很好的應用推廣前景。采用該12個位點上的indel分子標記可便于標準化、規模化、快速鑒定辣椒品種‘thi-p×tp023-p’真偽性或種子純度。