本發明屬于生物，尤其涉及一種基于核酸質譜技術檢測ugt1a1基因ta重復序列多態性的方法和應用。

背景技術：

1、伊立替康(irinotecan，cpt-11)是一種重要的抗癌藥物，通常用于治療轉移性結直腸癌和其他實體腫瘤。伊立替康屬于拓撲異構酶抑制劑類藥物，在體內被水解成活性代謝物sn-38，sn-38通過與拓撲異構酶i結合而抑制拓撲異構酶i的活性，進而干擾癌細胞的dna復制和修復，從而使癌細胞無法正常分裂和增殖，最終導致癌細胞死亡。sn-38隨后通過ugt1a1介導生成葡萄糖醛酸化sn-38(sn-38g)而失活，從而保護健康細胞免受伊立替康毒性的影響。伊立替康最常見的毒副作用為遲發性腹瀉和中性粒細胞減少，嚴重時可導致患者死亡。

2、ugt1a1是伊立替康活性產物sn-38轉化為失活產物sn-38g的關鍵酶，因此ugt1a1的基因多態性與伊立替康的不良反應密切相關，其中最常見的是ug?t1a1*28和ugt1a1*6這兩個多態性位點，已有大量研究表明可以用來預測伊立替康引起的毒副作用，也有研究表明ugt1a1的其他多態性位點，如ugt1a1*27、ugt1a1*60和ugt1a1*93也同樣具有預測伊立替康毒副作用的意義。美國fda早在2005年就要求在伊立替康藥物說明書上加入警示，建議患者在使用該藥物之前先進行ugt1a1*28檢測，根據突變類型謹慎考慮服用劑量。除此之外，一些報道也表明參與伊立替康及其代謝產物攝取和外排的轉運體，其遺傳多態性也是造成伊立替康毒性個體化差異的原因之一，如oatp1b1(slco1b1)，abc轉運蛋白，包括abcc2、abcb1和abcg2。因此，除了對ugt1a1突變類型的檢測，其他相關基因的多態性位點也同時需要檢測，以更好地輔助指導伊立替康的用藥。

3、目前針對ugt1a1及其他基因多態性的方法主要有qpcr、sanger測序、pcr-毛細管電泳、基因芯片等。在這些多態性位點當中，由于ugt1a1*28為7個ta重復序列，其野生型(ugt1a1*1)為6個ta重復序列，這種特殊的突變類型對于常規的qpcr檢測方法具有一定的難度。qpcr法需要設計特異性的探針和引物，按照傳統的設計思路，無論是探針還是引物放在ta重復區域上，由于ta重復個數較多且野生型與突變型僅相差1個ta，在擴增過程中，引物或探針都容易與ta重復區域發生錯配或形成引物二聚體和發夾結構，從而導致分型效果差，此外qpcr法通量低，無法單孔同時檢測較多個位點。sanger測序雖可以較好區分ta重復序列，但此方法操作繁瑣，通量低且成本高。pcr-毛細管電泳也被推薦用于ugt1a1*28多態性的檢測，但對于點突變較難確定突變的準確位點，檢測效果不佳，一般需要與其他技術進行結合，如asa。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(maldi-tof-ms)技術常被用于snp位點的檢測，具有高通量、操作簡便、靈敏度高、結果判讀簡單等特點，且引物設計也較為簡單，無需熒光探針和染料。

技術實現思路

1、本發明基于單堿基延伸技術和核酸質譜平臺設計了一種ugt1a1基因啟動子區(ta)n重復分型的方法，在避免引物之間形成發夾結構和二聚體的同時，能將(ta)5、(ta)6和(ta)7準確區分，并且該設計思路不局限于這一種多態性的檢測，同一類型的重復多態性檢測稍加調整也適用。

2、核酸質譜實驗主要分為富集、消化、延伸和上機檢測四個部分，延伸反應是指單堿基延伸引物(uep)退火時與目的基因結合后只延伸一個堿基便終止的過程，反應體系中一般加入的是四種不含3＇-oh的ddntp，即acyatp、acyctp、acygtp和經過修飾后的acyttp。本發明在延伸反應體系中只加入acyctp和acygtp兩種終止延伸堿基，而a和t堿基則加入普通的datp和dttp，因此，在uep和目的基因結合后，若模板的下一個堿基是c或g，則延伸一個堿基便終止，若下一個堿基是a或t，則在延伸t或a后不會終止延伸，直到遇到g或c堿基時再終止延伸。對于ugt1a1基因啟動子區(ta)n重復多態性的檢測，為了避免引物二聚體產生的非特異性延伸，本發明設計的uep序列只包含(ta)n重復序列中的3個ta，并引入一個鎖核酸以提高序列特異性。如果是野生型(ta)6，uep在延伸過程中將先延伸7個a和t堿基，最后終止于g堿基(如圖1)；如果是突變型(ta)7，則在延伸過程中先延伸9個a和t堿基，最后終止于g堿基；如果是突變型(ta)5，則在延伸過程中先延伸5個a和t堿基，最后終止于g堿基，相互間相差一個ta的分子質量，從而可以準確區分。

3、進一步地，在使用上述檢測方法時，為了使uep轉化完全，減少中間產物，本發明還提供了一種優化后的延伸反應程序，具體反應條件如下表所示：

4、

5、本發明還提供了一種伊立替康用藥相關基因多態性位點檢測試劑盒，能夠實現一個孔檢測多個基因的多個位點突變，靈敏度高且操作簡單，其技術方案如下：

6、通過查閱大量資料最終篩選出伊立替康用藥相關基因的12個遺傳多態性位點，包括ugt1a1*28(rs3064744)、ugt1a1*6(rs4148323)、ugt1a1*27(rs35350960)、ugt1a1*60(rs4124874)、ugt1a1*93(rs10929302)、abcc2

7、3972c>t(rs3740066)、abcc21249g>a(rs2273697)、abcc2-24c>t(rs717620)、abcb11236c>t(rs1128503)、slco1b1388a>g(rs2306283)、slco1b1521t>c(rs4149056)和abcg2421c>a(rs2231142)。

8、使用本發明上述所描述的新設計思路對這12個位點進行擴增引物和uep設計。考慮到引物數量較多，引物之間容易形成二聚體，使用multiple?primer?analyzer網站對設計好的所有引物進行引物間相互作用分析，去除存在嚴重的引物二聚體或引物3＇端非特異性結合的引物，并重新設計。每個突變位點的擴增引物和uep可多設計幾組，方便后續的篩選和驗證。

9、以全血樣本所提取的dna為模板，對設計好的擴增引物和uep進行篩選和驗證。其中擴增引物的質量采用毛細管電泳技術進行驗證，檢測擴增產物中是否有目的擴增片段，是否有明顯的非特異產物，引物擴增效率如何；uep則以核酸質譜技術為檢測方法，檢測是否生成目的延伸產物及延伸轉化效率的高低，以及是否存在非特異性延伸產物；綜合以上所有檢測后，最終確定的引物序列如下：

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11、

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13、所述引物組中，seq?id?no.1～24為各個突變位點的擴增引物序列，seq?id?no.25～36為各個位點的uep序列，其中ugt1a1*28_u2_lna(seq?id?no.25)引物中的“c+”表示該c堿基進行lna修飾。

14、本發明所提供的伊立替康用藥相關基因多態性位點檢測試劑盒包含上述所有引物。

15、除上述引物組外，所述試劑盒還包括三輪反應所需試劑，包含富集反應所用的預混液，即pcr緩沖液、dntps、mgcl2和taq?dna聚合酶；消化反應所用的消化緩沖液和sap酶；延伸反應所用的延伸緩沖液、uep酶、acyctp、acygtp、datp和dttp；以及三輪反應所需的無核酸酶水。

16、本發明還提供了一種基于核酸質譜技術檢測伊立替康用藥相關基因多態性位點檢測的實驗方法，具體包括以下步驟：

17、(1)以待測樣本dna為模板，進行第一輪的富集反應擴增，其中包含上述所有的擴增引物，即seq?id?no.1～24；

18、(2)對富集產物進行sap酶消化，以去除多余的dntps；

19、(3)對消化產物進行單堿基延伸反應，其中包含上述所有的uep，即seq?id?no.25～36；

20、(4)樹脂純化延伸產物去除鹽離子；

21、(5)飛行時間質譜上機檢測與分析。

22、與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

23、(1)基于單堿基延伸技術和核酸質譜平臺設計了一種ugt1a1基因啟動子區(ta)n重復分型的方法，對于這種特殊的突變類型，按照傳統的核酸質譜引物設計思路得到的引物在實驗中非常容易產生非特異性延伸，本發明巧妙地調整了延伸反應中的堿基類型和組成，實現了ugt1a1基因啟動子區(ta)n重復序列的準確分型。并且，該設計思路不局限于這一種多態性的檢測，對于同一類型的重復多態性檢測，只需將延伸反應中的原料堿基稍加調整也同樣適用。

24、(2)除了ugt1a1*28和ugt1a1*6這兩個常見的伊立替康用藥相關基因的多態性位點，本發明還提供了ugt1a1的其他多態性位點以及abcc2、abcb1、abcg2和slco1b1基因的多態性位點檢測，為伊立替康用藥指導提供更多的參考。

25、(3)本發明基于核酸質譜平臺對伊立替康用藥相關基因多態性位點進行多重檢測，在1個孔內實現12個多態性位點的檢測，檢測成本低且樣本用量少。此外，核酸質譜技術還具有操作簡便、靈敏度高、特異性高以及準確性高等優勢，同時也彌補了qpcr通量不足和測序技術成本高的缺陷。