本技術屬于分子生物學，具體涉及一種y染色體拷貝數變異檢測用的探針和引物、試劑盒。

背景技術：

1、近年來的研究表明，遺傳缺陷是導致男性不育的重要原因。而y染色體在其中扮演著重要角色，y染色體的近端著絲粒分為長臂和短臂兩部分，如長臂1區1帶中含有無精子癥因子，該基因片段的缺失被稱為ycms，是造成男性生精障礙的主要原因。研究證實10％-15％的無精子癥和5％-10％的嚴重少精子癥患者會出現ycms，且這種缺陷會遺傳給子代，因此對y染色體cnv變異的檢測具有重要意義。

2、目前針對y染色體的cnv變異檢測的方法主要有：多重連接探針擴增技術(mlpa)、實時熒光定量pcr技術(rt-qpcr)、微陣列比較基因雜交(array-cgh)、affymetrix?cnv芯片技術及第二代基因測序技術等。其中arrat-cgh、affymetrix?cnv芯片技術及二代測序主要用于全基因組的拷貝數變異檢測，準確而高效，但是成本也相對較高；rt-qpcr技術雖然簡便易操作，但其通量較低，難以實現對多個片段的同時檢測；mlpa是目前為止針對特定基因片段拷貝數檢測比較成熟的一種方式，通過一代測序平臺得以實現，然而這種方法也存在一定的局限性，例如對樣本dna要求較高、檢測通量較低、結果容易出現假陽性等。

技術實現思路

1、本技術的目的在于提供一種y染色體拷貝數變異檢測用的探針和引物、試劑盒，以解決現有技術中針對y染色體的cnv變異檢測存在的各種問題，并提供一種快速、全面、準確且低成本的y染色體拷貝數變異檢測技術。

2、為了實現上述目的，本技術第一方面提供了一種y染色體拷貝數變異檢測用的探針和引物，所述探針包括：

3、覆蓋位于y染色體的61個基因上共118個目標位點的118個探針組，所述118個目標位點的位置如說明書表1中no.1至no.118所示；

4、覆蓋位于參照基因上至少一個目標位點的至少一個所述探針組；

5、其中，每一所述探針組包括分別與目標位點的5’端和3’端至少部分互補的5’端探針和3’端探針；

6、所述引物包括針對所述探針組的正向引物和反向引物。

7、在一個或多個實施方式中，每一所述5’端探針包括依次排列的第一通用引物結合位點、第一連接序列，每一所述3’端探針包括依次排列的第二連接序列和第二通用引物結合位點，其中，所述第一連接序列和所述第二連接序列分別與目標位點的5’端和3’端至少部分互補；

8、所述引物包括：

9、針對所述第一通用引物結合位點的第一通用引物組，包括至少一個第一通用引物，每一所述第一通用引物至少與一個所述5’端探針的所述第一通用引物結合位點至少部分互補；

10、針對所述第二通用引物結合位點的第二通用引物組，包括至少一個第二通用引物，每一所述第二通用引物至少與一個所述3’端探針的所述第二通用引物結合位點至少部分互補。

11、在一個或多個實施方式中，針對y染色體上118個目標位點的118個探針組的第一連接序列如seq?id?no.1～118所示，第二連接序列如seq?id?no.119～236所示。

12、在一個或多個實施方式中，所述探針還包括：

13、覆蓋位于x染色體上的5個目標位點的5個探針組，所述x染色體上的5個目標位點的位置如說明書表1中no.119至no.123所示，針對x染色體的5個探針組的第一連接序列如seq?id?no.237～241所示，第二連接序列如seq?id?no.242～246所示。

14、在一個或多個實施方式中，所述探針包括覆蓋位于參照基因上的32個目標位點的32個探針組，所述參照基因的32個目標位點的位置如說明書表1中no.124至no.155所示，針對參照基因的32個探針組的第一連接序列如seq?id?no.247～278所示，第二連接序列如seq?id?no.279～310所示。

15、在一個或多個實施方式中，所述第一通用引物組包括四個第一通用引物，序列如seq?id?no.311～314所示，所述四個第一通用引物的5’端分別被不同熒光基團標記，所述第二通用引物組包括兩個第二通用引物，序列如seq?id?no.315～316所示；

16、每一所述探針組的5’端探針的第一通用引物結合位點選自seq?id?no.317～320所示序列中的一個，每一所述探針組的3’端探針的第二通用引物結合位點選自seq?idno.321～322所示序列中的一個。

17、為了實現上述目的，本技術第二方面提供了一種y染色體拷貝數變異檢測用的試劑盒，包括：

18、第一連接預混合液，包括4×gc?solution和探針混合液，所述探針混合液包括上述任一實施方式所述的探針；

19、第二連接預混合液，包括10×taq緩沖液和taq連接酶；

20、連接反應終止液，包括edta；

21、pcr預混合液，包括10×pcr緩沖液、dntp、mgcl2、引物混合液和taq?dna聚合酶，所述引物混合液包括上述任一實施方式所述的引物。

22、為了實現上述目的，本技術第二方面提供了一種上述任一實施方式所述的試劑盒的使用方法，包括：

23、將所述第一連接預混合液和樣本dna混合，之后加入所述第二連接預混合液進行連接反應，以使所述探針連接至目標位點；

24、加入所述連接反應終止液；

25、加入pcr預混合液，進行pcr擴增；

26、將擴增后的pcr產物變性后進行毛細管電泳，將擴增片段分離，得到每個所述擴增片段的信息并進行拷貝數計算。

27、在一個或多個實施方式中，所述探針包括若干探針group，每一所述探針group包括多個探針組，所述多個探針組包括至少一個針對y染色體的檢測探針組以及至少一個針對參照基因的參照探針組，且每一所述探針group的多個所述探針組對應于相同的正向引物和反向引物；

28、所述得到每個所述擴增片段的信息并進行拷貝數計算的步驟包括：

29、將所述探針group內的一檢測探針組a對應的擴增片段的熒光峰高值除以同一探針group內的一參照探針組b對應的擴增片段的熒光峰高值，得到所述檢測探針組a的r值；

30、將檢測樣本中所述檢測探針組a的r值分別除以n個正常男性參照樣本中所述檢測探針組a的r值再乘以正常參照樣本中所述檢測探針組a的拷貝數，得到所述檢測探針組a針對所述參照探針組b的n個校正拷貝數值，其中，所述檢測樣本為待檢測y染色體拷貝數的樣本，所述正常男性參照樣本為已知y染色體拷貝數正常的男性樣本；

31、基于所述n個校正拷貝數值，計算得到所述檢測探針組a針對所述參照探針組b的相對拷貝數；

32、重復上述步驟，分別計算所述檢測探針組a針對同一探針group內所有參照探針組的相對拷貝數，得到所述檢測探針組a的i個相對拷貝數；

33、基于所述i個相對拷貝數，得到所述檢測探針組a對應的擴增片段的拷貝數。

34、在一個或多個實施方式中，所述基于所述n個校正拷貝數值，計算得到所述檢測探針組a針對所述參照探針組b的相對拷貝數的步驟包括：

35、當n大于1時，判斷所述n個校正拷貝數值的變異系數是否小于或者等于第一閾值，若是，取所述n個校正拷貝數值的平均值作為所述檢測探針組a針對所述參照探針組b的相對拷貝數；

36、若所述n個校正拷貝數值的變異系數大于第一閾值，則依次剔除離所述n個校正拷貝數值的中位數最遠的校正拷貝數值，直至剩余的m個校正拷貝數值的變異系數小于第二閾值，其中，m大于或者等于2n/3，取所述m個校正拷貝數值的平均值作為所述檢測探針組a針對所述參照探針組b的相對拷貝數；

37、若不存在剩余的m個校正拷貝數值的變異系數小于第二閾值，則取所述n個校正拷貝數值的中位數作為所述檢測探針組a針對所述參照探針組b的相對拷貝數；

38、所述基于所述i個相對拷貝數，得到所述檢測探針組a對應的擴增片段的拷貝數的步驟包括：

39、判斷所述i個相對拷貝數的變異系數是否小于或者等于第三閾值，若是，取所述i個相對拷貝數的平均值作為所述檢測探針組a對應的擴增片段的拷貝數；

40、若所述i個相對拷貝數的變異系數大于第三閾值，則依次剔除離所述i個相對拷貝數的中位數最遠的相對拷貝數，直至剩余的j個相對拷貝數的變異系數小于第四閾值，其中，j大于或等于2n/3，取所述j個相對拷貝數的平均值作為所述檢測探針組a對應的擴增片段的拷貝數；

41、若不存在剩余的j個相對拷貝數的變異系數小于第四閾值，則取所述i個相對拷貝數的中位數作為所述檢測探針組a對應的擴增片段的拷貝數。

42、區別于現有技術，本技術的有益效果是：

43、本技術的引物和探針能夠覆蓋y染色體上61個基因共118個目標位點，能夠一次性實現y染色體上多位點的拷貝數變異檢測，既可以檢測大片段拷貝數變異又可以檢測微小的重復缺失，分辨率高，可以對6拷貝以內的位點進行準確定量；

44、本技術的試劑盒的使用方法流程簡單，僅包括連接反應和pcr反應，整個流程總共不超過24小時，檢測效率高；

45、本技術的試劑盒基于高特異性連接原理，檢測區域連接產物采用通用引物進行擴增，擴增效率基本一致，又有多個參照基因位點進行數據矯正計算，平均檢測cv<10％，可保證檢測結果的準確性；

46、本技術基于一代測序平臺完成檢測，與二代平臺相比成本更加低廉。