本發(fā)明涉及骨髓增殖性腫瘤，尤其涉及一種研究mpn患者骨髓上清液對(duì)mpn疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法。

背景技術(shù)：

1、骨髓增殖性腫瘤(mpn)作為一類由造血干細(xì)胞克隆性增殖引發(fā)的慢性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其復(fù)雜性與多樣性在臨床治療中構(gòu)成了顯著挑戰(zhàn)，經(jīng)典型的費(fèi)城染色體陰性mpn，主要包括真性紅細(xì)胞增多癥(pv)、原發(fā)性血小板增多癥(et)和原發(fā)性骨髓纖維化(pmf)，這些疾病不僅影響患者的血液成分平衡，還因其病程中頻繁出現(xiàn)的出血和血栓事件，以及潛在的急性白血病轉(zhuǎn)化或骨髓衰竭風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅患者的生命健康；

2、近年來(lái)生活方式的改變及環(huán)境因素的復(fù)雜多變，經(jīng)典型mpn的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，這使得對(duì)mpn發(fā)病機(jī)制的研究及有效治療策略的開發(fā)變得尤為迫切，值得注意的是，mpn不僅是一種造血系統(tǒng)的異常增殖性疾病，其發(fā)病機(jī)理還與慢性炎癥密切相關(guān)。骨髓微環(huán)境中的炎性細(xì)胞及其分泌的炎性因子在mpn的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色，這些炎性細(xì)胞因子不僅參與調(diào)節(jié)骨髓造血功能，還可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，進(jìn)而加速疾病的進(jìn)展；

3、現(xiàn)有研究表明，mpn相關(guān)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞均能分泌多種促炎細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子不僅參與全身癥狀的發(fā)生，還被證實(shí)為驅(qū)動(dòng)疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素，然而，盡管這些發(fā)現(xiàn)為我們理解mpn的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，但關(guān)于這些細(xì)胞因子如何具體作用于mpn細(xì)胞，以及它們?nèi)绾未龠M(jìn)疾病進(jìn)展的具體機(jī)制，目前仍缺乏深入的研究；

4、鑒于此本申請(qǐng)旨在通過(guò)采用來(lái)源于mpn患者的骨髓上清對(duì)mpn細(xì)胞系(如hel和tf1)進(jìn)行培養(yǎng)，以模擬體內(nèi)微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。通過(guò)觀察細(xì)胞系的生物學(xué)行為變化，如增殖速率、凋亡情況、遷移與侵襲能力等，可以更直觀地了解骨髓上清中可能存在的促腫瘤因子對(duì)mpn細(xì)胞的影響，同時(shí)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)差異分析，可以從基因?qū)用娼沂具@些促腫瘤因子如何調(diào)控mpn細(xì)胞的生物學(xué)特性，進(jìn)而為揭示mpn的發(fā)病機(jī)制提供新的線索。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)，而提出的一種研究mpn患者骨髓上清液對(duì)mpn疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

3、一種研究mpn患者骨髓上清液對(duì)mpn疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法，包括以下步驟：

4、分離和培養(yǎng)mpn患者的原代單核細(xì)胞(mnc)或使用tf1、hel細(xì)胞系作為替代模型；

5、通過(guò)免疫磁珠分選技術(shù)分離cd14+單核細(xì)胞和cd34+造血干/祖細(xì)胞；

6、使用mpn患者骨髓上清液處理tf1和hel細(xì)胞系，分析其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及表型的影響；

7、通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面tnf-α、tnfr1和tnfr2的表達(dá)水平；

8、對(duì)處理后的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)分析，篩選與mpn疾病相關(guān)的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路。

9、優(yōu)選的：所述tf1和hel細(xì)胞系的培養(yǎng)條件為：

10、使用rpmi?1640培養(yǎng)基，添加10％fbs和1％青霉素鏈霉素；

11、tf1細(xì)胞系額外添加2ng/ml?gm-csf；

12、細(xì)胞培養(yǎng)密度為2×105/ml，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中，每2天傳代一次。

13、進(jìn)一步的：所述免疫磁珠分選步驟包括：

14、使用lymphopreptm分離單核細(xì)胞(mnc)；

15、通過(guò)cd14免疫磁珠分選單核細(xì)胞，通過(guò)cd34免疫磁珠分選造血干/祖細(xì)胞；

16、分選前使用死細(xì)胞去除試劑處理樣本，分選后檢測(cè)細(xì)胞活性，確保分選效率。

17、進(jìn)一步的：所述mpn患者骨髓上清液的處理方法包括：

18、將骨髓樣本經(jīng)300g×10min離心分離血漿，分裝后儲(chǔ)存于-80℃；

19、使用不同濃度(0.5％、1％、2％、4％)的上清液處理tf1和hel細(xì)胞系；

20、在培養(yǎng)第三天補(bǔ)充上清液，第五天和第七天進(jìn)行功能驗(yàn)證。

21、作為本發(fā)明一種優(yōu)選的方案：所述流式細(xì)胞術(shù)分析包括：

22、使用cfse標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)增殖情況；

23、使用annexin-v?fitc/pi染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡；

24、檢測(cè)細(xì)胞表面tnf-α、tnfr1和tnfr2的表達(dá)水平。

25、作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)分析包括：

26、對(duì)1％濃度上清處理的tf1和hel細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；

27、對(duì)臨床樣本上清進(jìn)行蛋白組學(xué)測(cè)序；

28、通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選與mpn疾病相關(guān)的差異表達(dá)基因和蛋白。

29、作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析篩選出的關(guān)鍵基因包括：

30、cxcl8、cxcl10、ccr3、tnrsf10d和il1r1。

31、本發(fā)明的有益效果為：

32、1.一種研究mpn患者骨髓上清液對(duì)mpn疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法，能夠精確分離并分析mpn患者骨髓中的單核細(xì)胞亞群，特別是中間型單核細(xì)胞(im)和非經(jīng)典型單核細(xì)胞(ncm)，以及它們表面tnf-α、tnfr1和tnfr2的表達(dá)水平。

33、2.一種研究mpn患者骨髓上清液對(duì)mpn疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法，mpn患者的骨髓上清液對(duì)tf1和hel細(xì)胞系的增殖具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用隨上清濃度的增加而增強(qiáng)。

34、3.一種研究mpn患者骨髓上清液對(duì)mpn疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)對(duì)患者上清處理的hel和tf1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，成功鑒定出與mpn密切相關(guān)的基因，如cxcl8等趨化因子。

35、4.一種研究mpn患者骨髓上清液對(duì)mpn疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序部分，為深入研究mpn疾病的異質(zhì)性提供了可能，可以更加細(xì)致地描繪出mpn患者體內(nèi)不同細(xì)胞亞群的基因表達(dá)譜。

技術(shù)特征：

1.一種研究mpn患者骨髓上清液對(duì)mpn疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種研究mpn患者骨髓上清液對(duì)mpn疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，所述tf1和hel細(xì)胞系的培養(yǎng)條件為：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種研究mpn患者骨髓上清液對(duì)mpn疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，所述免疫磁珠分選步驟包括：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種研究mpn患者骨髓上清液對(duì)mpn疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，所述mpn患者骨髓上清液的處理方法包括：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種研究mpn患者骨髓上清液對(duì)mpn疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，所述流式細(xì)胞術(shù)分析包括：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種研究mpn患者骨髓上清液對(duì)mpn疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)分析包括：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種研究mpn患者骨髓上清液對(duì)mpn疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析篩選出的關(guān)鍵基因包括：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種研究MPN患者骨髓上清液對(duì)MPN疾病進(jìn)展影響的實(shí)驗(yàn)方法，涉及骨髓增殖性腫瘤技術(shù)領(lǐng)域；為了對(duì)MPN治療提供新思路；包括以下步驟：分離和培養(yǎng)MPN患者的原代單核細(xì)胞(MNC)或使用TF1、HEL細(xì)胞系作為替代模型；通過(guò)免疫磁珠分選技術(shù)分離CD14+單核細(xì)胞和CD34+造血干/祖細(xì)胞；使用MPN患者骨髓上清液處理TF1和HEL細(xì)胞系，分析其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及表型的影響，并進(jìn)行蛋白組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。本發(fā)明能夠精確分離并分析MPN患者骨髓中的單核細(xì)胞亞群變化，特別是中間型單核細(xì)胞(IM)和非經(jīng)典型單核細(xì)胞(NCM)，并通過(guò)組學(xué)分析篩選出影響MPN疾病進(jìn)展的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：許明麗
受保護(hù)的技術(shù)使用者：重慶醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/24